BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究

发布时间：2020-09-30 11:23

　　人涎腺黏液表皮样癌(Mucoepidermoid Carcinoma,MEC)是涎腺最常见的恶性肿瘤,约占涎腺恶性肿瘤的30%,尽管有时表现像良性病变,生长比较慢,但是该肿瘤有时是高度恶性而且预后很差。低分化的涎腺黏液表皮样癌侵袭和转移能力强,5年的存活率不超过43%。对于BZAP45(或BZW1)基因的相关研究的文献不多。至今仅知BZAP45是一种调节因子。而对于BZAP45基因是否有其他功能并没有文献报道,也未见有BZAP45基因与肿瘤相关的报道。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)作用机制为应用小的双链RNA引发序列特异性的基因表达的“沉默”或“敲除”。在哺乳动物细胞中这种双链RNA可以是短发夹结构RNA (Small hairpin RNA,shRNA);也可以是3'-端带有游离碱基的简单的二聚体(Small interference RNA, siRNA)。转染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往时间比较短,而且局限于容易转染的细胞系。应用于RNA干扰的载体有很多种,而利用慢病毒构建载体应用于基因沉默,是研究基因功能很好的方法。在本课题的前期研究中,我们初步发现在黏液表皮样癌组织和细胞中,BZAP45均高表达。在此基础上,本课题构建了BZAP45慢病毒干涉载体,将Mc3细胞中的BZAP45基因沉默,观察其体外和体内生物学特性的改变,并对其影响Mc3细胞生物学行为的机制进行初步探索。本课题主要的研究内容包括以下几个方面: 1.进一步确认BZAP45基因在黏黏液表皮样癌中高表达为验证基因芯片结果正确与否并且明确BZAP45基因是否为黏液表皮样癌特异性的差异表达基因,我们设计了BZAP45基因实时定量PCR的引物,进行实时定量PCR检测;并预制了BZAP45基因的多克隆抗体,对4例肿瘤组织(制备成15个样本)和4例正常组织进行了免疫组化染色。结果显示,BZAP45基因在黏液表皮样癌细胞和组织中表达均比正常细胞和组织高。 2. BZAP 45基因RNA干扰慢病毒载载体的制备及黏黏液液表皮样癌细细胞胞感染针对靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4个针对BZAP45基因的RNA干扰靶点序列;合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的载体上,将连接好的产物转入制备好的感受态细胞,对长出的阳性克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的BZAP45基因RNA干扰慢病毒载体。选择干涉效果最好的序列,经过病毒的小量包装、大量包装、滴度检测及浓缩后获得足够滴度的慢病毒溶液,利用慢病毒载体感染Mc3细胞,利用有限稀释法挑选阳性单克隆,并利用时定量PCR对获得的细胞进行鉴定,从而获得了稳定感染的细胞株。 3. BZAP 45基因干涉后Mc3细胞体体体外外及及体体内内生生物物学学行为的改变为了研究BZAP45基因在Mc3细胞中可能的作用,我们将BZAP45基因干涉,使其沉默后,利用MTT法、细胞计数法、平板克隆形成实验观、细胞划痕实验、transwell实验、HE染色、透射电镜等方法察Mc3细胞体外的生物学行为的变化情况,利用裸鼠移植瘤方法观察了Mc3细胞干涉前后在裸鼠体内的生长情况。结果显示,BZAP45基因沉默后,Mc3细胞体外增殖变缓,细胞的群体倍增时间由原来的约23 h增为约48 h;克隆形成能力下降,克隆形成率由原来的78%下降为20%;体外迁移能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞迁移的距离分别为65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667±3.066μm;体外侵袭能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞到达小室底面的细胞数分别为85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7个;细胞超微结构改变,干涉后细胞核染色质浓缩、碎裂、边集于核膜,呈境界清楚的块状或半月状;体内成瘤速度变缓,抑瘤率约为57.95%。 4. BZAP 45影响MMCC 3细细细胞胞胞生生生物物物学学行行为为的的机机制初探为研究BZAP45影响MC3细胞生物学行为的机制,我们利用流式细胞仪检测了干涉前后细胞周期分布的改变,并利用免疫荧光检测了细胞周期相关因子、凋亡相关因子以及细胞增殖相关因子的表达改变,结果显示,BZAP45基因干涉后,细胞出现G1期阻滞,干涉前后p53、c-myc和P21的表达无明显变化;干涉后,caspase3的表达有所升高,而cyclin-D1和PCNA的表达有所降低。结论: 1. BZAP45基因在黏液表皮样癌组织和细胞中高表达。 2.成功构建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉载体。并成功将MC3细胞的BZAP45基因干涉,获得了稳定的细胞株。 3. BZAP45基因被干涉后,Mc3细胞的体内和体外的生物学特性发生改变,细胞的恶性程度下降。 4.BZAP45基因可能与黏液表皮样癌的发生和/或发展有关。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

基因结构,野生型

[62]，成功构建了自我灭活型载体系统( self-inactivationvectors，SIN)。这一系统保留了野生型病毒(图1)基因的顺式作用元件LTR，包装信号(φ)，及Rev基因的反应元件。去除了vif，vpr，vpu， nef等致病基因，保证了载体的生物安全性。将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，通过三个质粒共同转染包装细胞产生完整的病毒颗粒。也就是说

序列,系统构成,质粒,表达蛋白

也就是说，慢病毒载体系统主要由三种包含不同结构的质粒构成，分别是转移质粒(transfer vectors)，辅助质粒(helper plasmids)，包膜表达质粒(envelop expression plasmids)。结构如图2。其中，转移质粒除包含我们感兴趣的外源基因外，同时还保留了病毒的LTR区和其他对病毒的整合复制起重要作用的元件。其中LTR区包含了慢病毒的启动子、增强子、包装信号、整合位点(attachment site，Att)等结构。包装序列能够使识别病毒RNA将其衣壳化并装配到病毒颗粒中，Att位点使病毒基因可以整合入宿主基因。同时转移质粒中还加入了内部启动子驱动外源基因转录。辅助质粒整合进入包装细胞后表达蛋白多聚体gag，编码病毒的衣壳蛋白及病毒的其他模序结构(matrix structure)，同时表达蛋白pol， pol蛋白具有逆转录酶及整合酶的活性

机制,多程,降解机制,RNA序列

降解机制研究表明，RNAi引起的基因沉默是由dsRNA诱导的多程，长度为2l-23nt的siRNA(small interfering RNoRNA)两种类型的small RNA发挥了核心功能作用[92]。，对靶基因进行转录后负调控，靶mRNA并不发生变上的抑制效应，植物中的某些miRNA会与特异mRNA相割，表明miRNA作用类似于siRNA[93]。最新的研究结果主要作用因子[94]。这里主要对siRNA介导的靶mRNA降以下几个步骤：形成诱导细胞RNAi的关键组分，外源DNA、RNA序列均可RNA，但产生的方式不同。RNA病毒在病毒或细胞中R dependent RNA polymerases，RdRP)的催化下，合

【参考文献】