初级纤毛对人牙周膜细胞增殖和成骨向分化及感知静压力的影响

发布时间：2020-10-12 22:31

　　 背景:牙周膜是连接着牙槽骨和牙骨质的特殊致密结缔组织。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)通常指牙周膜中以成纤维细胞为主的细胞群,具有多向分化和自我更新的能力,在牙周组织再生治疗和正畸治疗中都发挥着重要作用。初级纤毛是广泛存在于多种细胞表面的保守细胞器,缺失会导致一系列“纤毛病”。初级纤毛的形成和维持需要纤毛运输蛋白(Intraflagella Transport,IFT)不断的货物运输。IFT88为FT-B复合体的核心组分,破坏此蛋白会导致初级纤毛形成缺陷。近年来大量研究发现,初级纤毛在感知机械应力,调节骨平衡方面发挥着重要作用。目的:第一部分:构建IFT88基因沉默模型抑制hPDLCs初级纤毛的形成。探讨抑制hPDLCs中初级纤毛形成后对其增殖和成骨分化能力的影响。第二部分:利用转录组学分析探讨初级纤毛在hPDLCs感知静压力过程中发生变化的相关纤毛基因和调控机制。方法:第一部分:组织块法原代培养和鉴定hPDLCs,取第4-7代细胞进行实验。构建shIFT88慢病毒载体,对hPDLCs进行慢病毒感染,得到IFT88基因沉默表达的hPDLCs细胞株(shIFT88组),同时感染无意序列作为对照(NC组)。western blot和定量PCR检测IFT88沉默效率,免疫荧光检测初级纤毛的形成率。平板克隆实验和MTT实验检测细胞增殖,定量PCR检测NC组和shIFT88组成骨相关因子COLIA1、ALP、Runx2、BMP2表达量变化。第二部分:模拟正畸压应力构建体外静压力模型。取第4-7代NC组和shIFT88组细胞接种于6孔板,NC组和shIFT88组分别设置不加静压力的对照组和施加2g/cm2静压力4h的实验组。收样提取RNA,检测RNA质量合格后送样进行建库,测序,筛选出差异基因(differentially expression genes,DEGs)并进行分析。结果:1.免疫荧光显示:人牙周膜细胞表面存在初级纤毛,纤毛率为60.27±1.83%。2.成功构建hPDLCs中IFT88基因沉默模型。沉默IFT88基因表达后,hPDLCs初级纤毛率明显降低(P0.01)。3.hPDLCs中初级纤毛形成抑制后细胞增殖能力明显减弱(P0.01),成骨相关因子 COL1A1、ALP、Runx2、BMP2 表达量明显下调(P0.01)。4.测序结果分析得出,与不加静压力的对照组细胞相比,施加静压力4h后,NC组有840个差异表达基因,shIFT88组有498个差异表达基因。5.将差异表达基因与纤毛金标准库进行比对,NC组发现8个上调纤毛基因和2个下调纤毛基因,shIFT88组未发现相关纤毛基因。KEGG通路富集分析发现TGF-beta signaling pathway 和 osteoclast differentiation 在 NC 组发生富集,而在shIFT88组未发生富集。选取部分差异表达基因进行荧光定量PCR验证,变化趋势与转录组学分析结果一致。结论:人牙周膜细胞存在初级纤毛,IFT88基因沉默能有效抑制初级纤毛的形成。初级纤毛形成抑制后hPDLCs增殖能力减弱,成骨相关因子的基础表达量明显下调,说明初级纤毛有可能参与调控hPDLCs的增殖和成骨向分化。hPDLCs感知静压力过程中NC组多个纤毛基因发生变化,TGF-beta signaling pathway和osteoclast differentiation均被激活,抑制初级纤毛形成后这些纤毛基因和通路的变化均未被检测到。初级纤毛可能通过这些纤毛基因调控TGF-beta信号通路和诱导破骨细胞分化进而参与hPDLCs感知静压力调节骨平衡的生理过程。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781
【部分图文】：

稳态的研宄进展做以下综述。??１．纤毛的基本结构和功能??１．１纤毛的基本结构（图１）??纤毛的结构在进化上非常保守，主要包括轴丝、基体、过渡区、纤毛膜和基??质几个部分ｔｌ９’２°］。纤毛内没有合成蛋白质的体系，这些蛋白质在胞质中合成，依??靠纤毛内运输（ＥＦＴ）系统，沿着轴丝微管运输到纤毛中，同时ＥＦＴ将代谢废物等??运出纤毛，完成纤毛的组装和维持％?２１］。ＩＦＴ复合体分为ＩＦＴ－Ａ和ＩＦＴ－Ｂ两??种复合体，目前研宄认为，ＩＦＴ－Ｂ复合体可能在与正向分子马达结合的同时，与??轴丝前体蛋白相结合，将其运入纤毛，而ＥＦＴ－Ａ复合体与反向分子马达结合，??将纤毛内的蛋白运出纤毛［２２］。??１．２纤毛的基本功能??根据有无中央微管，我们可将纤毛分为“９＋２”型的动纤毛和”９＋０”型的原??纤毛

２．?３．１?ｐＬＫＯ．?１?载体??ｐＬＫＯ．?１为ＴＲＣ?（ｔｈｅ?ＲＮＡｉ?Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）组织建立的复制缺陷型慢病毒载体，??能够持续表达ｓｈＲＮＡ，载体图谱如图２所示。??ｓｈＲＮＡ??Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ??Ｕ６?ｃＰＰＴ??〇?ｐＬＫＯ．１?ｐｕｒｏ?ｆｔｓｉｎ３＇ＬＴＲ??５?ＬＴＲＵ?ｗｉｔｈ?ｓｈＲＮＡ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ?＇??７．０９１?ｂｐ??ｐＵＣ??Ａｍｐ?Ｒ??图２：ｐＬＫＯ．?１载体图谱??２．３．２?ｓｈＲＮＡ载体构建??向ＴＲＣ公司提交ＩＦＴ８８基因序列得到一系列备选序列，筛选得分较高的序??列添加到〇ｌｉｇ〇中，〇ｌｉｇ〇引物列表如表１所不??１２??

搜乐苣は赴?鲋澈统晒窍蚍只?案兄?惭沽Φ挠跋欤崳?１?ｈＰＤＬＣｓ存在初级纤毛??如图３所示，ｈＰＤＬＣｓ存在初级纤毛（乙酰化ｔｕｂｕｌｉｎ标记初级纤毛），共统??计５个样本，每个样本于２０倍镜头下随机选取５个视野，依次统计细胞数和初??级纤毛个数，得出纤毛率。纤毛率为６０．２７±１．８３％。??图３：免疫荧光显示初级纤毛：乙酰化ｔｕｂｕｌｉｎ（绿色荧光）和ＤＡＰＩ?（蓝色荧光）的??定位，白色箭头指示部分初级纤毛。（Ｂａｒ＝２５ｕｍ）??２检测慢病毒感染后ｈＰＤＬＣｓ中ＩＦＴ８８表达的变化。??实验分为两组：ＮＣ组为感染无意序列组ｈＰＤＬＣｓ，?ｓｈ［ＦＴ８８组为感染带有??ｓｈＩＦＴ８８序列的慢病毒的ｈＰＤＬＣｓ。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果（图４Ａ）显示：与ＮＣ组相??比，ｓｈＩＦＴ８８组丨ＦＴ８８基因表达水平下调至０．?０２?（；？〈０．?０１）；?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ结果显示??（图４Ｂ）ｓｈＩＦＴ８８组几乎检测不到丨ＦＴ８８，表达量明显低于ＮＣ组。说明慢病毒感??染后ＩＦＴ８８基因沉默效果明显。??Ａ?Ｂ??１．２?ｒ??－??４＜ｊ￡?ｚ?Ｈ??麵義〇．４?．?■麵邏吓丁８８??７５??＊＊?５０?ｐ－ｔｕｂｕｌｉｎ??０．０１————??ＮＣ?ｓｈＩＦＴ８８??图４：慢病毒感染ｈＰＤＬＣｓ后丨ＦＴ８８表达水平（Ａ）?ｑＲＴ－ＰＣＲ检测丨ＦＴ８８表达情况，??＊＊ｐ＜０．?０１；?（Ｂ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?检测?ＩＦＴ８８?表达情况。??２１??
【参考文献】

相关期刊论文 前5条

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本文编号：2838370