miR-34a介导机械应力作用下成骨分化的体内外实验研究

发布时间：2020-10-15 13:07

　　 正畸临床中理想的矫治效果基于矫治器的选择、治疗方案的设计以及条件较适宜的牙周组织。正畸牙齿移动过程中的基本理论依据为压力侧骨吸收张力侧骨形成,来保持牙齿在牙槽骨中的生理性移动。而此过程中牙槽骨的基本条件和骨改建是牙齿移动的生物学基础。然而正畸临床中经常会面临牙槽骨条件较差的问题,尤其是成年患者,由于其牙槽骨的形成受先天后天因素的影响,经常看到牙槽骨组织的吸收、疏松(或致密)、缺损等状态。这种牙槽骨组织的缺陷是无法通过矫治器或矫治技术弥补的,因此不能达到较好的矫治效果。而且目前正畸临床和实验研究中尚没有针对改善牙槽骨基本条件的治疗理念和方法措施。随着生物技术的飞速发展,基因治疗已经深入到各项领域,在以往的正畸研究中,针对牙齿移动的机制和影响研究仍限于细胞分子、蛋白和信号通路水平,而针对分子水平的研究较罕见。micro RNA是一类内源性单链RNA分子,调节人类接近60%的基因和蛋白的表达,是近几年来靶基因治疗的热门研究。许多研究中均报道了正畸力作用下micro RNA的基因芯片检测,micro RNA和机械力学可相互作用调节,对机械力作用下的骨改建发挥着精密而必不可少的调控作用。其中mi R-34a是一类骨代谢方面报道较多、作用较明确的micro RNA。mi R-34a主要用于癌症的抑制研究,然而近年来学者们发现mi R-34a不仅抑制了各种肿瘤细胞的增殖、生长和迁移,同时也显著抑制了癌症的骨转移现象,因此近五年来针对mi R-34a参与骨改建的研究逐渐揭开面纱。自2014年Nature的一篇研究报道了mi R-34a对骨调控的重要作用,尤其是破骨细胞,mi R-34a关于各类骨细胞、干细胞的相关研究逐渐增加起来。mi R-34a不仅是天然的破骨细胞抑制剂,也对成骨分化的过程进行复杂调节作用。此外mi R-34a与软骨发育、骨组织修复反应以及牙齿发育过程的关系也逐渐被报道。然而由于micro RNA自身结构的不稳定性、表面带负电荷以及易被核酸酶降解等缺点,常需要阳离子聚合物递送系统进行转运。PEI25K是衡量非病毒阳离子聚合物递送能力的金标准,其具有高效转染效率、高度结合能力、质子缓冲能力强等优势,但是却隐含较大的细胞毒性的危险。因此学者们通过化学修饰的方法将PEI25K进行改性进而降低毒性作用。N-Ac-L-Leu-PEI是PEI25K改性后的派生物,其除具有PEI25K良好装载和转染能力外,尚具有良好的细胞安全性,降低了PEI25K的毒性。已在国外知名杂志的研究中被报道。本研究拟应用N-Ac-L-Leu-PEI递送载体实现mi R-34a的体内和体外转染过程。众所周知,micro RNA发挥主要调控作用是通过其与靶向基因的3’端非翻译区碱基互补配对结合进而降解或抑制靶基因的表达。在此我们通过研究mi R-34a介导的正畸力作用下骨改建机制,来寻找mi R-34a的潜在靶因子。通过机制和靶因子的研究更有助于我们理解mi R-34a介导正畸力骨改建作用的途径,以及后期对递送载体进行修饰,嫁接具有靶因子的特殊基团,进而提高mi R-34a作用的特异性,提高效率。根据以上,我们拟研究mi R-34a在机械力作用下骨改建过程中的变化情况,以及mi R-34a对机械力作用下骨改建的影响作用,并探讨mi R-34a影响作用的可能机制。本研究具体内容分五部分实验展开:实验1正畸牙齿移动中成骨分化与mi R-34a表达的变化情况采用Wistar大鼠,建立体内实验性牙齿移动模型;提取、培养、诱导大鼠骨髓干细胞,通过四点弯曲细胞力学加载仪建立体外应力模型,采用HE染色、免疫组织化学染色、q RT-PCR、ALP活性、ALP染色、western blot等研究方法,检测体内移动牙齿牙槽骨成骨分化和体外BMSCs在力学作用下的成骨分化水平,以及在此过程中mi R-34a在体内和体外的表达水平变化情况。实验2 N-Ac-L-Leu-PEI对mi R-34a递送能力检测采用N-Ac-L-Leu-PEI作为micro RNA的递送系统进行研究,并与商业化Lipofectamine 2000的转染效能进行比较,通过表征检测、凝胶阻滞实验、MTT实验、流式细胞仪和荧光显微镜等检测以及体内转染效率q RT-PCR检测和生物安全性检测,评价N-Ac-L-Leu-PEI对micro RNA的递送能力与生物安全性。实验3机械力作用下mi R-34a对体外大鼠骨髓干细胞成骨分化的影响作用体外研究mi R-34a对应力介导的BMSCs成骨分化影响作用,采用N-Ac-L-Leu-PEI递送载体进行micro RNA转染,通过mi R-34a过表达和mi R-34a抑制检测应力作用下BMSCs的成骨分化基因和蛋白表达水平以及ALP活性。实验4 mi R-34a对大鼠牙齿移动和牙槽骨改建的影响作用体内研究mi R-34a对力学作用下介导的牙槽骨骨改建影响作用,同样采用N-Ac-L-Leu-PEI递送载体进行体内micro RNA局部运送,通过q RT-PCR、HE染色、免疫组织化学染色、micro CT分别检测mi R-34a过表达和mi R-34a抑制对力作用下牙齿移动距离、成骨分化基因和蛋白、骨代谢指标的影响作用。实验5探讨mi R-34a介导的力学骨改建初步机制通过Western blot实验方法初步探究mi R-34a介导的力学下成骨分化的机制,首先检测张力作用下Wnt/β-catenin信号通路的活化情况;其次应用N-Ac-L-Leu-PEI递送micro RNA至BMSCs,通过mi R-34a过表达和mi R-34a抑制分别检测张力作用下Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的变化情况;最后抑制靶因子后过表达和抑制mi R-34a,检测对力作用下Wnt/β-catenin通路蛋白的影响。以阐明mi R-34a介导机械力作用下骨改建的基本机制。通过上述5部分实验,得出以下结果:实验1成功建立大鼠牙齿移动模型和体外干细胞力学加载模型,力作用下可于体内的HE染色和免疫组化染色切片内发现较多Runx2阳性细胞,体内和体外Runx2、Col I、ALP基因表达增加,Runx2和Col I蛋白表达提高,ALP活性显著增加。同时mi R-34a的表达水平也增高了,在每个检测时间点增高趋势与成骨分化基因的变化水平同步,且具有时间依赖性。实验2 N-Ac-L-Leu-PEI具有较低的粒径与电位,可与mi R-34a形成纳米级混合物(直径约200nm);质量比2:1时即可完全结合mi R-34a;N-Ac-L-Leu-PEI转染后细胞相对增殖度均保持在90%以上,体现良好的生物安全性;N-Ac-L-Leu-PEI具有较高的转染效率,且细胞安全性和转染效率均高于商品化的Lipofectamine 2000;体内研究中,局部注射mi R-34a agomir和antagomir后q RT-PCR结果显示组织中mi R-34a的表达量分别为29倍和0.4倍;体内肝功与肾功的生化指标正常、心肝脾肾肺组织形态学无异常;实验3 mi R-34a过表达后可提高力学作用下Runx2和Col I基因和蛋白水平以及ALP活性。mi R-34a抑制后其作用与mi R-34a过表达相反。实验4 mi R-34a过表达可促进牙齿移动过程中牙槽骨成骨分化基因和蛋白(Runx2、Col I、ALP)的表达,骨合成代谢参数(BV/TV、BMD、Tb.N、Tb.Th)提高,骨分解代谢参数降低(Tb.Sp),牙齿移动距离减少。mi R-34a抑制后对以上作用表现为相反。实验5应力抑制了GSK-3β蛋白表达且促进了活化β-catenin蛋白的表达,进而激活了Wnt/β-catenin信号通路;在加力状态下,mi R-34a过表达可抑制GSK-3β的表达,激活β-catenin蛋白的活化,促进Wnt/β-catenin信号通路释放,mi R-34a抑制后对GSK-3β和β-catenin蛋白的表达作用相反;基因软件预测和荧光素酶检测显示mi R-34a的靶基因为GSK-3β;将GSK-3β基因抑制后,mi R-34a对以上力学作用下Wnt/β-catenin信号通路蛋白的调控作用丧失。通过以上实验,可以得出以下结论:1.体内和体外研究均证明机械力促进了成骨分化和骨形成作用,而此过程中mi R-34a的表达显著提高,且呈时间依赖性;2.N-Ac-L-Leu-PEI可与mi R-34a形成稳定复合物,实现体内和体外安全、高效的递送,保证mi R-34a发挥生物作用;3.在体外研究中,mi R-34a可促进牵张力作用下的成骨分化作用;4.在体内研究中,mi R-34a通过促进移动牙齿周围牙槽骨的骨形成作用,减低牙齿移动距离;5.在机制研究中,我们发现机力激活了Wnt/β-catenin信号通路,mi R-34a可通过靶向作用GSK-3β来激活Wnt/β-catenin信号通路。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R783.5
【部分图文】：

吉林大学博士学位论文1.1.2 方法1.1.2.1 大鼠正畸牙齿移动模型建立按照 King[111]的实验方法建立大鼠正畸牙齿移动模型，如图 2.1 所示。应用戊巴比妥钠（6 μl/g）行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上，牵拉上颌前牙固定于手术台打开大鼠口腔。用高速涡轮车针在大鼠右侧第一磨牙和前牙的龈缘水平处做一浅凹，用 0.20mm 正畸结扎丝结扎，在两牙之间置正畸螺旋弹簧，牵拉弹簧，应用正畸 ZL-1 型测力计使弹簧产生 50g 力值，将弹簧固定结扎。左侧不放置加力装置作为对照组。大鼠苏醒后常规饲养。每天检查装置，如果脱离及时更换。

吉林大学博士学位论文浸泡过夜，双蒸水冲洗 10 遍，75%酒精浸泡消毒过夜，三蒸水冲洗干净，烘干，无菌超净台内紫外灯双面照射 6 小时以上。取第三代 BMSCs 按 5×105/板接种于加力板的中心 5cm×3.6cm 区域，24 小时后细胞贴壁，加入含成骨诱导液的 L-DMEM 细胞培养液，进行力学加载，每日2 小时牵张力，连续加载 3 天、5 天、7 天。对照组不加力。参照 Li[178]的实验方法，采用四点弯曲细胞力学加载仪对实验组细胞施加周期性、单轴向张应力，指标设置为 0.5Hz、1mm（相当于 2000με）、2 小时。如图 2.2 所示。

吉林大学博士学位论文11. 二抗（1:3000）封闭,80 转/分，室温摇晃 1 小时；12. TBST 洗膜，80-90 转/分，10 分钟/次，3 次；用 ECL 化学发光显色试剂盒中试剂 A 和试剂 B 各 1ml 混匀后，滴加在 PVDF膜上，放入仪器内检测。1.1.2.9 统计学处理本研究数据均应用 SPSS 19.0 软件系统进行统计学分析,所得结果均以均数±标准差（χ ±S）表示。各组间数据比较采用方差分析及配对 t 检验，双侧检验水准为α=0.05，p 值：* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001，与空白对照组比较。1.2 结果1.2.1 大鼠正畸移动牙齿周围组织学检测
【参考文献】

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1 李书琴;杨珊;任嫒姝;戴红卫;;张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达调控的体外研究[J];华西口腔医学杂志;2015年01期

2 Juan Xu;Bo Yu;Christine Hong;Cun-Yu Wang;;KDM6B epigenetically regulates odontogenic differentiation of dental mesenchymal stem cells[J];International Journal of Oral Science;2013年04期

3 ;Cell biology in orthodontic tooth movement:The known and the unknown[J];上海口腔医学;2005年02期

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2 侯建华;EphrinB2/EphB4信号介导正畸牙移动压力区骨改建的实验研究[D];吉林大学;2014年

本文编号：2842207