Wnt5a在腭发育及维甲酸诱导腭裂发生中的表达及其与Shh、FGF-10相关性的研究

发布时间：2020-11-01 06:13

　　 背景:腭裂(Cleft Palate, CP)是口腔颌面部最常见的先天性发育畸形,占所有先天性畸形的65%左右,全世界新生儿发生率1/700,在我国发生率为1.82‰。在已知能诱发腭裂的环境因素中,维生素A的衍生物全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)是致畸作用比较显著的一种, atRA所诱导的腭裂形成的机制尚不明确。小鼠腭裂的发生形式与人类腭裂发生非常相似,而小鼠基因与人类的同源性高达99%以上,因此深入了解小鼠腭裂发生机制将为剖析人类腭裂发生奠定理论基础。本实验应用稳定的维甲酸诱导小鼠腭裂模型,观察正常组和实验组胚鼠的腭突发育的形态学变化;借助免疫组织化学法和分子生物学RT-PCR技术,观察Wnt5a基因在维甲酸诱导腭裂及正常对照组腭突发育中的表达和分布的改变,同时检测信号分子Shh和FGF-10在不同的发育阶段的表达水平变化。 目的:通过观察Wnt5a与Shh, FGF-10在正常腭突发育和腭裂形成中不同发育阶段的表达和分布改变,探讨其在腭发育过程中发挥的作用以及维甲酸诱导腭裂中的发生机制;并进一步探索信号分子Wnt5a与Shh,FGF-10之间是否存在相关性。 方法:建立维甲酸诱导的腭裂小鼠模型,采用免疫组织化学技术检测Wnt5a在胚胎14, 15及16天的实验组和对照组小鼠腭突中的蛋白水平表达和分布变化。采用RT-PCR方法检测信号分子Wnt5a,Shh和FGF-10在转录水平的表达变化。 结果:1、维甲酸对腭突融合的影响:维甲酸实验组小鼠腭裂发生率为100%。HE染色结果显示:对照组小鼠腭突发育正常,双侧腭突在中线处接触融合。实验组小鼠腭突发育瘦小,腭突上抬障碍、舌体下降明显延迟,两侧腭突不能在中线处接触融合。2、Wnt5a蛋白表达在腭突发育各个主要时期的上皮和间充质细胞中,且表达呈时空变化。在ED 15实验组,Wnt5a的mRNA的表达被上调且高于对照组(P0.05)。3、Shh和FGF-10在腭突发育的不同阶段持续表达,在正常对照组中Wnt5a与Shh、FGF-10表达水平的动态变化趋势一致,在实验组Wnt5a只与FGF-10的变化趋势具有相关性。 结论:1、维甲酸作用于小鼠发育早期,腭突发育短小、腭突上抬障碍、舌体下降明显延迟,两侧腭突不能在中线处接触融合,从而导致腭裂的发生。2、Wnt5a参与胚胎腭突的发生发育,在腭突发育过程中的表达具有时空特异性,并与Shh和FGF-10的表达具有相关性。3、Wnt5a与Shh, FGF-10在RA诱导腭裂小鼠腭突组织中的异常表达提示维甲酸可能通过调节Wnt5a、Shh和FGF-10等信号分子而导致了腭裂。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R782.2
【部分图文】：

结 果一 、维甲酸对腭突融合的影响1、动物模型制备情况共计得正常对照组胚鼠 68 只，实验组胚鼠 88 只。其中正常对照组胚鼠均发育正常，实验组胚鼠部分伴有四肢发育异常，肢芽尾巴短小，偶见眼睛发育异常。实验组小鼠全部伴发腭裂，腭裂发生率高达 100％。2、正常胚鼠的腭突发育的形态学变化在光学显微镜下，观察正常胚鼠腭部发育的动态过程：ED14 腭突位于舌体两侧垂直生长，舌体位置很高，接近鼻中隔。ED14.5 舌体开始下降，腭突开始发生上抬。ED15 舌体下降，腭突上抬至舌上方，并发生水平的定向生长，继而两侧腭突接触，接触后形成中嵴上皮带，后断裂形成上皮岛，部分中嵴上皮消失，开始融合。ED16 双侧腭突发生接触融合，中嵴上皮完全消失，间充质贯通，并开始骨化，腭板发育完成(图 1)。

图 2 维甲酸诱导腭裂组胚鼠腭突发育的形态学变化 HE×25A: ED14 胎鼠 B: ED15 胎鼠 C: ED16 胎鼠C57BL/6J 近交系小鼠腭突动态发育模式图垂直生长 上 抬 水 平 生 开始融合 融合完胚胎 14 天 胚 胎 14.5 胚胎 15 天 胚胎

图 4 Wnt5a 蛋白在腭突中的分布和表达A、 C、 E：正常对照组 ED14、 ED15、 ED16B、 D、 F：实验组 ED14、 ED15、 ED16E×100， A、 B、 D×200， C、 F×400四、半定量 RT-PCR 检测信号分子 Wnt5a、Shh、FGF-10 在腭突发育及维甲酸诱导腭裂中的表达水平1、 Wnt5a、 Shh、 FGF-10 转录水平表达的变化扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测（如图5、7、8），获得特异性条带，均未见明显杂带及引物二聚体，扩增产物具有较高的特异性。Wnt5a， Shh， FGF-10 在正常腭突发育的不同阶段呈现持续的表达，但不同发育阶段表达水平不同。在维甲酸诱导的腭裂中与正常组的表达水平不同（表 2）。表 2 Wnt5a，Shh，FGF-10 半定量 RT-PCR 产物的光密度值比值的平均值对照组对照组对照组实验组实验组实验组
【参考文献】

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本文编号：2865135