miRNA-92a作用EBAG9基因调控前列腺癌增殖机制研究

发布时间：2017-04-10 09:25

  本文关键词：miRNA-92a作用EBAG9基因调控前列腺癌增殖机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究前列腺癌细胞中的micro RNA-92a对EBAG9基因的表达及其对前列腺癌细胞增殖的调控机制。方法:应用micro RNA靶基因数据库预测软件mi Randa、Target Scan、Pic Tar,预测mi RNA-92a中的靶基因,再应用mi Rwalk取交集基因中210个基因,从中筛选与肿瘤相关的10个靶基因,通过往前列腺癌细胞系PC3中转染mi RNA-92a的模拟物mimic、抑制物inhibitor和其各自的对照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,24h后分别提取其RNA,分别利用RT-q PCR方法检测上述筛选的靶基因的m RNA转录表达情况,并对其结果进行统计学检验。根据统计学结果筛出靶基因EBAG9,再转染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的对照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,48h后提取总蛋白,利用Western blot检测EBAG9的蛋白表达情况。结合Oncomine数据库,收集天津市泌尿外科研究所40例前列腺癌及正常的前列腺增生组织,提取其RNA并行RT-q PCR,检测EBAG9基因在肿瘤组织及正常组织的分布。用micro RNA数据库预测软件预测mi RNA-92a与EBAG9的潜在作用位点;设计EBAG9引物,利用PCR扩增其3’UTR片段,并分别用琼脂糖凝胶电泳鉴定;目的基因及带有荧光的质粒分别使用限制性内切酶酶切,最后将质粒与目的基因连接,构建含有EBAG9的3’UTR荧光报告质粒;将质粒扩增进而获取高浓度质粒,限制性内切酶酶切后行琼脂糖凝胶电泳后予以验证,使用基因测序进而验证其正确性后;分别将含有EBAG9片段的重组质粒及mi RNA-192a表达质粒共转染入293T细胞,后用荧光报告检测系统检测转染后的荧光素酶活性。结果:1.用数据库预测软件mi Randa、Target Scan、Pic Tar、mi Rwalk,成功筛选出与肿瘤相关的10个靶基因。2.转染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的对照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 24h后,RT-q PCR验证各个实验组EBAG9基因在m RNA水平上变化有显著的统计学意义。3.转染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的对照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 48h后的EBAG9基因表达蛋白电泳结果表明,分别抑制和增强PC3细胞的mi RNA-92a后,EBAG9基因蛋白水平与m RNA水平变化保持一致且具有显著的统计学意义。4.相对于正常前列腺增生组织及细胞,EBAG9基因在前列腺癌细胞及组织中显著高表达。5.成功构建EBAG9的野生型3’UTR区片段,并经琼脂糖凝胶电泳验证其正确性。6.成功构建含有野生型的EBAG9的3’UTR区序列的重组质粒,并按正确方向与含有双荧光素酶报告基因载体成功链接,扩增获得高浓度质粒,酶切后的片段用琼脂糖凝胶电泳验证正确。7.使用大肠杆菌扩增野生型重组质粒得到高浓度质粒并经测序结果验证正确。8.使用罗氏成功转染重组质粒和mi R-92a表达质粒至293T细胞后,使用酶标仪测双荧光素酶活性,结果显示,相对于对照组,mi R-92a可以显著降低含有EBAG9的3’UTR的重组质粒的荧光素酶的活性并具有显著的统计学意义。此实验显示EBAG9为mi RNA-92a的靶基因。结论:1.EBAG9基因在前列腺癌细胞及组织中显著高表达,通过临床病理及资料分析,其与其肿瘤的分级、分期显著正相关。2.mi RNA-92a作用EBAG9的3’UTR进而调控前列腺癌细胞的增殖。3.随着研究的深入,可进一步寻找EBAG9基因的主要转录调节因子,进而探讨其复杂的调控机制。
【关键词】：前列腺癌 增殖 microRNA-92a 靶基因 调控 转录
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-19
• 研究现状、成果13-18
• 研究目的、方法18-19
• 一、miRNA对靶基因EBAG9基因的影响19-44
• 1.1 对象和方法19-33
• 1.1.1 细胞系及组织标本19
• 1.1.2 模拟试剂及引物的合成19-20
• 1.1.3 常用耗材及试剂盒20-21
• 1.1.4 主要的设备及仪器21-22
• 1.1.5 实验的试剂配置及过程22-25
• 1.1.6 实验各种方法25-33
• 1.1.7 统计学结果的处理33
• 1.2 结果33-40
• 1.2.1 miR-92a的靶基因预测及结果33-34
• 1.2.2 转染模拟物后靶基因mRNA水平上验证34-37
• 1.2.3 蛋白印记电泳法Western blot检测前列腺癌细胞系PC3细胞转染模拟物之后的EBAG9基因的表达37-38
• 1.2.4 EBAG9基因在前列腺癌组织和BPH组织中的表达情况38-40
• 1.3 讨论40-43
• 1.4 小结43-44
• 二、miRNA-92a对EBAG9基因调控机制的研究44-60
• 2.1 对象和方法44-53
• 2.1.1 实验材料44-47
• 2.1.2 实验方法及步骤47-53
• 2.1.3 统计学分析方法53
• 2.2 miRNA-92a对EBAG9基因调控机制的研究结果53-57
• 2.2.1 miRNA-92a与靶基因位点结合示意图及目的基因片段琼脂糖凝胶电泳结果53-54
• 2.2.2 酶切后的重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图54-55
• 2.2.3 含有EBAG9基因序列的片段及miRNA-92a过表达质粒测序结果55-56
• 2.2.4 miRNA-92a过表达质粒对含有EBAG93’UTR质粒双荧光素酶抑制效果56-57
• 2.3 讨论57-59
• 2.4 小结59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-64
• 发表论文和参加科研情况说明64-66
• 综述 MicroRNA在前列腺癌研究中的进展66-76
• 综述参考文献71-76
• 致谢76-77
• 个人简历77

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本文编号：296425