磷酯酰胆碱特异性磷脂酶C在蛛网膜下腔出血引起的早期脑损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2017-05-06 03:08

  本文关键词：磷酯酰胆碱特异性磷脂酶C在蛛网膜下腔出血引起的早期脑损伤中的作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:应用SAH后EBI模型,探讨磷酯酰胆碱特异性磷脂酶C在蛛网膜下腔出血引起的早期脑损伤中的作用及其机制。方法:第一步,将成年雄性SD大鼠72只,随机分为假手术组(sham组,n=18)、SAH+溶剂对照组(n=18)、SAH+D609-L(低剂量为5毫克/千克)组(n=18)和SAH+D609-H(高剂量为10毫克/千克)组(n=18)。D609由Sigma(M-5250)购买,并和溶剂对照组一样溶解在生理盐水中。D609和和溶剂对照组在SAH半小时之后以相同剂量腹腔内注入。上述所有组,分别在SAH后12小时,24小时和48小时取得大鼠的血液及脑组织样本,每个时间点各取六只大鼠研究PC-PLC的活性,以及D609对PC-PLC活性的影响。第二步,将96只老鼠随机分为四组:假手术组,SAH+溶剂对照组,SAH+D609-L组和SAH+D609-H组(n=24每组)。基于时间进程研究的结果,在SAH之后48小时,取得大鼠的血液和脑组织样本。每一组的24只老鼠中,6只进行血脑屏障(BBB)完整性检测,6只进行脑水肿指数评价,同时每组中取6只大鼠的脑组织包埋在石蜡中,切成4微米厚度的石蜡切片用于进行末端转移酶缺口末端标记(TUNEL)染色和免疫荧光分析,每组其它6只大鼠的脑组织进行匀浆并溶解在冰冷RIPA裂解缓冲液(Beyotime,P0013),用于进行Western blot分析。通过玻璃巴斯德移液管进行眶后穿刺收集大鼠的血液,随后从血液中获得血清并储存在-80℃冰箱内,直至用于PC-PLC活性和炎性细胞因子分析。然后,所有大鼠经水合氯醛深度麻醉(36毫克/100克体重)后,除了需要进行脑水肿评估的大鼠之外,对剩余大鼠使用冰冷PBS进行心脏灌流后,取出脑组织。结果:一般观察所有实验组大鼠的体重,平均动脉血压,体温或注射动脉血气数据均未发生显著变化。大鼠死亡率,假手术组为0%(0/42),SAH组为11.8%(17/143)。前交叉池注血可能导致自主呼吸停止,一般持续时间约10秒,很快恢复正常呼吸。SAH后大鼠脑组织和血清中PC-PLC活性上调与假手术组相比,SAH组大鼠脑组织中PC-PLC活性显著升高。这种PC-PLC活性在脑组织内的升高,在SAH诱导后24小时和48小时更为突出。所有血清样本也进行了PC-PLC酶活性测定。在假手术组,血清PC-PLC活性处于低水平,在SAH诱导后24小时没有发生明显变化,但是在SAH诱导后48小时的大鼠血清中,检测到了PC-PLC活性的显著增加。值得注意的是,D609以10毫克/千克给药时同时有效抑制了SAH诱导的脑组织和血清中的PC-PLC活性。而D609以5毫克/千克给药时仅能抑制SAH后24小时和48小时脑组织内的PC-PLC活性升高,这表明大剂量D609对SAH导致的PC-PLC活性升高有更加强大的抵抗作用。PC-PLC活性抑制减弱了由SAH导致的神经行为学障碍与假手术组相比,在SAH诱导后48小时,大鼠表现出严重的神经行为学障碍,当使用两个剂量的D609进行腹腔注射后,神经行为学障碍出现明显的逆转。此外,与低剂量D609相比,高剂量D609对于改善SAH大鼠神经功能缺损具有更好的效果。PC-PLC活性抑制逆转SAH所致的脑损伤为了评估D609治疗SAH后血脑屏障完整性的效果,我们进行了伊文思蓝外渗测定。与假手术组相比,伊文思蓝外渗在SAH组中检测时显著升高。伊文思蓝外渗平均值在给予两种剂量的D609进行治疗后都出现了下降。结果显示D609治疗可以减轻大鼠SAH模型后的血脑屏障损伤。随后,我们进行脑含水量测定来评价D609治疗对于SAH后脑水肿的影响。SAH引起脑含水量显著增加,在D609治疗后脑含水量明显减少。结果表明SAH加重脑水肿,D609治疗显著减轻了脑水肿。PC-PLC活性的抑制减弱SAH诱导的神经元和脑微血管内皮细胞的凋亡为了研究D609诱导的SAH后脑保护的底层机制,采用TUNEL/的Neu N和定量TUNEL/v WF的双重免疫标记来定量神经元和大脑细胞凋亡指数的改变。与假手术组相比,SAH组神经元和脑微血管内皮细胞凋亡指数均显著提高。值得注意的是,与SAH组相比,D609治疗恢复了脑部神经元和脑微血管内皮TUNEL阳性细胞百分比。Western blot检测显示,D609治疗减弱了凋亡蛋白引起的蛋白质水平增高,其中包括由SAH诱导产生的活性胱天蛋白酶3和bax。所有的结果都证实了D609对于SAH后神经细胞和脑微血管内皮细胞的抗凋亡效应。PC-PLC介导了SAH诱导的炎症反应随着越来越多的证据表明PC-PLC对于细胞凋亡和炎症之间串扰起到了重要作用,我们测试了D609对炎症相关因子,包括IL-1β,IL-6和TNF-α的血浆浓度的影响。测量显示SAH组IL-1β,IL-6和TNF-α的血浆浓度增加。值得注意的是,D609的治疗显著减少了IL-6和TNF-α的血浆浓度,这表明了D609的抗炎作用。但是,D609治疗无法显著减少IL-1β的血浆浓度。Oxy Hb上调培养神经元的PC-PLC的活性我们进一步分析了Oxy Hb是否会改变体外培养的原代大鼠皮层神经元中PC-PLC的活性。使用Oxy Hb对培养的原代大鼠皮层神经元进行24小时的刺激,发现PC-PLC活性增加。此外,Oxy Hb介导的PC-PLC酶激活过程,在使用D609治疗后出现明显的终止。PC-PLC活性抑制明显提高了经过Oxy Hb处理的神经元的存活率为了进一步明确PC-PLC在SAH诱导的神经元细胞凋亡中的潜在作用,我们测试了D609对Oxy Hb处理的原代培养大鼠皮层神经元存活率的影响。首先进行的形态学测定法结果显示,与假手术组相比,Oxy Hb处理后的神经元表现出体细胞和神经元分枝凝集功能缺失,这与神经元细胞死亡的形态学特征是一致的。值得注意的是,两个剂量的D609均能显著缓解Oxy Hb诱导的形态学变化。此外,与对照组相比,低剂量D609轻微和不显著的增加了神经元的存活率,而高剂量D609则显著增加了神经元存活率。结论:SAH时循环和脑组织中的PC-PLC活性上调,这可能导致过度炎症反应的发生,并损害血脑屏障的完整性,这一点通过使用PC-PLC抑制剂作为SAH诱导的EBI的治疗策略进一步得到了证实。因此,我们推测,D609能抑制PC-PLC的活性,从而减轻炎症反应和细胞凋亡,并最终逆转SAH诱导的血脑屏障损伤和脑水肿。
【关键词】：蛛网膜下腔出血 早期脑损伤 磷酯酰胆碱特异性磷脂酶C D609
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.35
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-17
• 参考文献14-17
• 材料与方法17-25
• 结果25-35
• 讨论35-37
• 结论37-38
• 参考文献38-42
• 综述42-55
• 参考文献49-55
• 附图55-58
• 中英文缩略词表58-59
• 攻读学位期间公开发表的论文59-60
• 致谢60-61

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