降钙素基因相关肽促进人脐静脉血管内皮细胞增殖及其相关机制的初步研究

发布时间：2017-11-08 05:33

  本文关键词：降钙素基因相关肽促进人脐静脉血管内皮细胞增殖及其相关机制的初步研究

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【摘要】：由于创伤、感染等各种原因造成的骨折、骨缺损、骨不愈合等一直是威胁人类生命健康的医学难题。对于如何从根本上提高其治疗效果,明确骨再生、重建、塑形的病理生理学特点及其相关生物学作用机制是其基础和出发点。骨组织是一种伴随着细胞外基质矿化、可以根据需要不断进行自我修复的复杂动态组织,亦是带有血管、神经支配的生物活性组织,因此,骨折修复的过程中既与人体内多种组织、细胞因子之间错综复杂的协同作用相关,也与骨组织的血液供应、神经支配紧密相关,因此重建修复区域内环境生物学的稳定性,尤其是重建血液供应和神经支配是关键步骤。血液供应的恢复对于保障骨组织及移植物生物学活性的重要性已经被许多基础实验及临床实践所证实,除此之外,神经因素可能在骨组织再生过程中同样发挥着重要作用。 骨骼是一种可根据需要不断修复的生物活性组织,骨再生和骨重建是一个复杂的持续的动态过程,受体液和生物动力学等多种因素共同调节,尤其是与血液供应和神经支配密切相关。早已有学者们通过解剖学的研究发现骨组织中存在着大量神经纤维,这些神经纤维多围绕血管周围并与之伴行,分布于骨膜、骨表明及骨髓等活跃区域。随着研究的深入,已经证实,骨组织的神经纤维为肽能神经,可分泌多种神经肽参与调控多种生理功能,降钙素基因相关肽(CGRP)是具有代表性的神经肽之一。降钙素基因相关肽(calcilonin gene-related peptide, CGRP)是一种含有37个氨基酸的生物活性多肽,由降钙素基因组织特异性选择性剪接所产生,广泛分布于中枢系统、外周神经系统及某些器官组织当中,参与和调节多种重要功能。CGRP是周围神经中含量最多的一种神经肽,也是目前已知最强的内源性血管扩张肽,具有很强的血管扩张作用。研究证实CGRP在骨修复及重建过程中具有重要作用,降钙素基因相关肽免疫反应神经纤维的出现与血管相关,并且和骨组织中的骨髓细胞,骨细胞和其它细胞均有相关性。这些神经纤维经常以串珠状、类似静脉曲张的外观出现。CGRP免疫阳性神经纤维广泛分布于骨膜、骨髓腔、干骺端等处。CGRP可能具有多种功能,可以作为神经递质,血管扩张剂和神经营养效应器发挥作用。CGRP可以促进血管内皮细胞增殖而促使血管形成,从而增加局部的血流。有研究表明,骨折患者的血浆中,CGRP浓度明显增加,骨折局部CGRP阳性神经纤维数量也明显增加。脑外伤患者骨折愈合速度较普通骨折患者快,且与血浆中高浓度CGRP相关。因此推测CGRP可能通过轴浆运输到骨折局部,扩张局部血管,增加骨折局部的血液供应,从而促进骨折愈合。Aoki等学者的研究也证实,在大鼠胫骨骨折模型中,骨折愈合时,骨膜、新生骨组织和纤维肉芽组织之中出现许多CGRP阳性神经纤维,且多数位于血管附近,这些感觉神经纤维可以在局部释放出明显高于血清水平的CGRP,参与骨折愈合过程。 血管内皮细胞广泛分布在血管内壁,是血管内壁的重要组成部分。研究发现骨组织具有高度血管化,在骨中,血管内皮位于骨髓的毛细血管腔壁内,与骨细胞、骨周围神经都存在着紧密的联系。血管化在骨修复和重建过程中发挥重要作用,血管形成是骨形成、再生、重塑的基础,在骨再生过程中,血管的形成要明显早于骨的形成,血管可以向组织器官提供氧气,输送营养物质等,并可分泌多种生长因子,包括BMP、VEGF、OPG、IGF-1、bFGF、CO等,从而促进成骨细胞增殖及骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化,以促进成骨；同时抑制破骨细胞的活性,阻止其骨吸收作用；还可通过VEGF等直接作用于血管,影响新生血管的形成,进而调节骨的修复。血管生成能恢复骨折区域的血运,并能产生相关生长因子以调节成骨细胞活性,聚集干细胞、定向分化成骨细胞以促进骨形成。而血管内皮细胞基膜的降解、增殖和迁移是新血管形成所必需的前提条件,成为骨修复的关键步骤。 前期研究发现,CGRP可作为局部刺激因素刺激HUVECs增殖,CGRP对HUVECs的增殖作用具有时间-浓度依赖性。且在10-8mol/L作用最强。本实验在此基础上,进行了更加深入的研究,不仅从正向进一步证实CGRP对HUVECs具有明显的促增殖作用,而且还加入了CGRP拮抗剂CGRP8-37及MAPK通路相关蛋白拮抗剂同时从反向验证此效应,并从细胞信号转导通路方面,对其具体作用机制进行了初步的探讨。 研究目的 ●进一步明确神经肽CGRP促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的作用。 ●从细胞信号转导通路角度,初步探讨神经肽CGRP在HUVECs促增殖作用中的生物学机制。 第1部分人脐静脉血管内皮细胞的获取和鉴定 目的： 获取人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),对细胞表面特异性标记物(Ⅷ因子)进行免疫荧光鉴定,并用其作为种子细胞进行进一步相关研究。 方法： 获取人脐静脉血管内皮细胞 新生儿剖宫产脐带离体2h以内进行实验,长度大约22cm。以连接有50mL注射器的7号输液针头斜行插入脐静脉内,然后以镊子固定针头,用含肝素的PBS液冲洗脐静脉内血液,直至液体颜色清亮,将脐静脉内多余的PBS液挤压出。使用钳子夹闭脐带两端,由针筒缓慢注入0.1%Ⅰ型胶原酶溶液至静脉充盈,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中消化20min。消化后用止血钳挤压揉搓脐带外壁,使内皮细胞脱落。收集消化液,并以含肝素的PBS液冲洗脐静脉2-3次；收集冲洗液,以离心半径15cm、800r/min离心10min后弃上清,加入EGM培养基,种植于1%明胶包被的培养瓶中培养。48h后全量换液,此后每3天换液1次,细胞融合达80%后消化传代。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。 鉴定人脐静脉血管内皮细胞 用第1代细胞行vWF免疫荧光鉴定。待细胞在盖玻片上生长融合为单层后,4%多聚甲醛固定30min,正常山羊血清封闭30min;加入兔抗vWF抗体,置于湿盒中4℃过夜；加入DyLight594标记的山羊抗兔IgG,置于37℃中30min；以5μg/mL DAPI染核10min,缓冲甘油封片,倒置荧光相差显微镜下观察。 结果： 体外成功分离培养出人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),经免疫荧光鉴定符合血管内皮细胞特征。 结论： 胶原酶消化培养法可获得大量人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),从而为下一步的研究提供了种子细胞。 第2部分降钙素基因相关肽人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用 目的： 进一步探讨降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖的影响和作用。 方法： AlarmarBlue法检测各组HUVECs增殖 将实验组划分为6组,分别是空白对照组、CGRP组、CGRP+CGRP8-37组、CGRP+PD98059组、CGRP+SB203580组、CGRP+SP600125组。利用AlarmarBlue法检测各组人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖变化情况。每组设3个复孔,各组分别进行预处理,24h后每孔加入10μL AlamarBlue,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱静置4h后,用多功能酶标仪设置激发波长530nm和发射波长590nm处测定荧光值,整个操作过程要避光进行。 结果： 与空白对照组相比,CGRP组能够明显促进HUVECs的增殖,而在经过CGRP拮抗剂CGRP8-37、ERK1/2拮抗剂PD98059、p-38拮抗剂SB203580、JNK拮抗齐SP600125预干预后的各实验组中,CGRP诱导的HUVECs增殖效应可受到明显的抑制。 结论： CGRP能够促进HUVECs的增殖,并且此效应可被ERK1/2、p-38、JNK拮抗剂所抑制,提示MAPK通路在此过程中起作用,CGRP的生物学机制可能通过MAPK通路发挥作用。 第3部分降钙素基因相关肽促进人脐静脉血管内皮细胞增殖的生物学机制初步探讨 目的： 初步探讨降钙素基因相关肽(Calcitonin-gene-related peptide, CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)促增殖作用的生物学作用机制。 方法： 将实验组划分为6组,分别是空白对照组、CGRP组、CGRP+CGRP8-37组、CGRP+PD98059组、CGRP+SB203580组、CGRP+SP600125组。免疫印迹技术(Western blot)观察CGRP诱导后ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化表达变化情况,及CGRP8-37、PD98059、SB203580、SP600125预处理对ERK1/2、p-38、JNK磷酸化表达的影响。 结果： CGRP可在一定范围内呈时间依赖性地诱导HUVECs细胞ERK1/2、p-38、 JNK的磷酸化,拮抗剂CGRP8-37、PD98059、SB203580和SP600125预处理后可减弱其磷酸化作用。 结论： ERK1/2、p38、JNK的磷酸化参与并调控CGRP促人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的生物学作用过程,这提示MAPK通路中ERK1/2、p38和JNK三个途径均在此过程中起到作用,CGRP可能通过MAPK信号转导通路途径影响HUVECs的增殖。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

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