金黄色葡萄球菌肠毒素B作为免疫佐剂的研究

发布时间：2021-08-08 16:47

动物疫病的频发给养殖业发展造成了困扰,尤其是病毒性疫病缺少有效的治疗,积极的免疫预防是不可或缺的。目前畜禽用的疫苗有各种类型,包括很多新型疫苗,如亚单位疫苗,重组疫苗和合成多肽疫苗等,但此类疫苗免疫原性较弱,单独免疫难以达到有效的免疫效果,开发活性高而副作用低的新型免疫佐剂的研究日益迫切。佐剂是指与抗原同时或预先应用,能增强机体针对抗原的免疫应答能力,提高免疫效果的物质；目前研究的佐剂有上百种,其功能主要是增强机体应答、减少抗原接种剂量和接种次数、促进疫苗在免疫应答能力弱的群体中的免疫效果、加快免疫应答的速度和延长持续时间等,具备这种免疫功能的物质都有成为免疫佐剂的潜力。金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素B(SEB)是一种具有超抗原性质的外毒素,具有MHC结合的非限制性；可激活外周血T细胞,调节NK细胞以及刺激淋巴细胞产生TFN-α和活化Thl细胞等功效。能够刺激T细胞活性,提高机体免疫水平,尤其是细胞免疫水平。SEB非特异性地激活免疫细胞,引起众多细胞因子产生的能力使其具备成为免疫佐剂的潜力。本课题的研究内容主要包括：根据SEB DNA序列设计合成了一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌S6株基因组为模板,采用PCR方法扩增了SEB基因并克隆到pMD18-T载体,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,结果表明该基因全长720 bp,与已报道的PM36株序列同源性达100%。构建了原核表达质粒pKG-SEB和pET-28a-SEB,并分别在大肠杆菌中进行了高效表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果分别出现了与预期分子量大小一致的54 KD和28 KD的蛋白条带,Western-blotting分析表明表达的融合蛋白产物均具有良好的生物学活性,为今后进一步的研究奠定了坚实基础。将含有禽流感病毒H5亚型HA1的原核表达载体pKG-HA1在大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物上清及包涵体进行SDS-PAGE电泳分析,出现了与预期融合蛋白GST-HA1分子量大小一致的蛋白条带约60 KD,且目的蛋白多以包涵体形式存在。本实验采用几个浓度的重组SEB和标准SEB分别与AIV H9/NDV二联灭活苗免疫两周龄艾维因肉鸡,通过对抗体滴度及淋巴细胞活性的测定反映SEB的免疫增强效果。实验数据显示重组SEB按5μg/只的剂量免疫肉鸡时有较好的免疫增强效果；在免疫前期SEB免疫组较疫苗对照组抗体效价增长快,7d和14 d时,重组SEB中剂量组抗体效价比疫苗对照组高约2.0个滴度,到28 d时,仍比疫苗对照组抗体效价高约1.5个滴度,统计分析表明SEB免疫组的效价显著高于疫苗对照组(P0.05),重组SEB中剂量组与其他SEB免疫组的效价均有显著差异(P0.05)；淋巴细胞活性在免疫后15d达最高,重组SEB中剂量组比疫苗对照组高约2.5倍,统计分析差异显著(P0.05),到25 d时差异减小但仍显著。将重组SEB按5μg/只的剂量分别与AIV H5灭活苗、重组蛋白GST-HA1免疫雏鸡,同时设各对照组,实验数据显示重组SEB对灭活苗及重组亚单位苗的免疫都起到了增强效果,其中疫苗和SEB免疫组的抗体效价显著高于疫苗免疫组和疫苗空载免疫组(P0.05),HA1和SEB免疫组的抗体效价也显著高于HA1免疫组(P0.05)。 SEB作为一种超抗原具有超强的免疫激活能力,本实验通过三次动物实验优化了SEB较好发挥免疫效果时的免疫剂量,实验表明适当剂量的SEB可增强机体对疫苗的免疫应答,无论是体液免疫还是细胞免疫。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

文章目录

摘要

Abstract

第一章文献综述

1 疫苗免疫的现状

1.1 灭活苗

1.2 弱毒苗

1.3 亚单位疫苗

1.4 合成肽疫苗

1.5 基因工程载体疫苗

1.6 基因工程缺失苗

1.7 抗独特性抗体疫苗

1.8 基因疫苗

1.9 转基因植物疫苗

2 佐剂的研究进展

2.1 铝盐佐剂

2.2 弗氏佐剂

2.3 免疫刺激复合物(ISCOMs)

2.4 脂质体

2.5 寡脱氧核苷酸(oligodeoxyneucleotide,ODN)

2.6 细胞因子

2.7 细菌毒素

2.8 蜂胶

3 超抗原及金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的研究进展

3.1 超抗原的研究

3.1.1 超抗原的定义和发现

3.1.2 超抗原的特性

3.1.3 超抗原的免疫效应

3.2 SEB的特性

3.2.1 SEB的生物学特性

3.2.2 SEB的超抗原性

3.2.3 SEB的免疫学功能

3.3 SEB的临床应用

第二章金黄色葡萄球菌肠毒素B、禽流感病毒H5HA1的克隆与表达

1 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 载体及菌株

2.1.2 酶及主要试剂

2.1.3 标准抗原及阳性血清

2.2 主要溶液的配制

2.2.1 抗生素类

2.2.2 细菌培养基

2.2.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳相关溶液

2.2.4 质粒抽提相关溶液

2.2.5 SDS-PAGE相关溶液

2.2.6 Western-blotting相关溶液

2.2.7 表达提取纯化表达蛋白的相关溶液

2.2.8 其它试剂

2.3 试验方法

2.3.1 引物设计

2.3.2 目的片段的扩增

2.3.3 PCR产物的回收与纯化

2.3.4 PCR产物的克隆

2.3.5 感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.3.6 质粒的转化

2.3.7 质粒的制备(碱裂解法)

2.3.8 序列测定

2.3.9 DNA重组技术(DNA酶切、连接)

2.3.10 重组表达质粒的酶切鉴定

2.3.11 原核表达载体的构建

2.3.12 大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达

2.3.13 重组蛋白的表达提取

2.3.14 重组蛋白的纯化

2.3.15 包涵体的制备

2.3.16 包涵体的纯化与复性

2.3.17 蛋白浓度的确定

2.3.18 表达蛋白的SDS-PAGE分析和Western-blotting鉴定

3 结果与分析

3.1 SEB的PCR扩增

3.2 SEB基因克隆和鉴定

3.3 SEB基因的序列测定与分析

3.4 重组质粒pKG-SEB和pET-28a-SEB的酶切鉴定

3.5 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE分析结果

3.6 重组蛋白表达产物的Western-blotting鉴定结果

4 讨论

4.1 目的蛋白的选择

4.2 目的基因的克隆

4.3 融合蛋白表达产物的处理

4.4 融合蛋白表达产物的纯化

5 结论

第三章金黄色葡萄球菌肠毒素B作为免疫佐剂的研究

1 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物及抗原

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液

2.1.4 主要实验器材

2.2 试验方法

2.2.1 免疫原的准备

2.2.2 动物试验

2.2.3 MTT法测定淋巴细胞增值实验的步骤

2.2.4 血凝抑制实验检测血清抗体实验步骤

3 结果与分析

3.1 SEB佐剂效应试验结果

3.2 重组SEB较优剂量选择试验结果

3.3 重组SEB增强亚单位疫苗免疫效果试验结果

4 讨论

4.1 SEB剂量的确定

4.2 免疫指标的选择

4.3 淋巴细胞活性测定方法的选择

5 结论

参考文献

致谢

【参考文献】