LPS与CD59单克隆抗体联合激活补体抗肿瘤效应的研究

发布时间：2021-04-01 19:13

目的:国外报道在多种实体肿瘤细胞中如肠道、卵巢、前列腺等已发现有CD59分子的过表达,并证实其与肿瘤的失控性生长、恶性转化密切相关。本研究利用转基因技术建立高效真核表达系统,观测人卵巢癌A2780细胞表面野生型CD59与突变型CD59分子的表达情况及其抗补体活性变化,推断W40位点的生物学活性;并探讨突变型CD59基因转染与LPS联合、以及LPS与CD59单克隆抗体联合激活补体的抗肿瘤效应。方法:利用大肠杆菌JM109扩增突变型CD59质粒和野生型CD59质粒,并用阳离子脂质体(Lipfectine)将两种重组质粒分别转染入人卵巢癌A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆。并用RT-PCR、酶免疫染色、荧光免疫染色、Western-blot、流式细胞术在mRNA水平和蛋白水平鉴定CD59突变基因和野生型基因的转染成功。通过MTT法计算细胞增殖抑制率及LDH乳酸脱氢酶释放法观察突变型CD59和野生型CD59抗补体能力的改变,以及CD59mAb与LPS联合作用激活补体抗肿瘤效应。结果:通过RT-PCR、酶免疫染色、荧光免疫染色、Western-blot、流式细胞术鉴定说明建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞。MTT结果显示与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与对照组未转染的A2780细胞无显著差别;在5 mg/L LPS单独作用30 min后,MTT检测对转染野生型CD59,突变型CD59及未转染A2780细胞的细胞增殖抑制率分别为(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差异有统计学意义。LDH释放试验结果显示对突变型CD59转染的A2780细胞,其补体杀伤率为65.13±9.77明显高于野生型CD59转染的A2780细胞,差别有统计学意义(p＜0.05);与CD59mAb、LPS的单独作用组相比,两者联合作用在5mg/L和10mg/L时,补体的细胞杀伤率均明显高于单独作用组,差别有统计学意义(p＜0.05)。结论:CD59的W40位点对其抗补体活性具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,并有助于LPS发挥抑制瘤细胞增殖活性;CD59mAb与LPS较低剂量联合即可明显激活补体对人卵巢癌A2780细胞的杀伤活性,为高表达CD59的肿瘤治疗提供了新思路。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R730.5;R392

文章目录

摘要

ABSTRACT

引言

技术路线

第一章材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备

1.1.2 质粒、菌株与细胞株

1.1.3 主要实验试剂

1.2 方法

1.2.1 突变型和野生型CD59重组质粒的扩增和鉴定

1.2.2 A2780细胞转染及稳定转染细胞系的建立

1.2.3 稳定转染细胞阳性克隆的筛选

1.2.4 兔抗人CD59多抗的制备

1.2.5 CD59分子的生物学活性检测

第二章结果

2.1 重组质粒的酶切鉴定

2.2 重组质粒转染A2780细胞的筛选和鉴定

2.2.1 免疫荧光检测

2.2.2 免疫酶法检测

2.2.3 流式细胞术

2.2.4 Western-blot

2.2.5 RT-PCR

2.3 MTT结果

2.4 LDH结果

第三章讨论

3.1 CD59蛋白和突变型CD59蛋白的真核表达

3.2 CD59的生物学功能和W40位点活性研究

3.3 LPS与CD59mAb的联合抗肿瘤效应

结论

参考文献

综述

参考文献

硕士研究生期间第一作者发表的文章

附录

附录1 试剂的配制

附录2 CD59 cDNA序列

致谢

【参考文献】