AMPK和CaMK Ⅱ在收缩调节骨骼肌细胞GLUT4转位中的作用

发布时间：2018-05-31 00:27

  本文选题：葡萄糖转运子4 + 收缩　； 参考：《天津医科大学》2009年硕士论文

【摘要】：肌肉是动物机体利用葡萄糖最重要的组织,其糖代谢是维持机体内环境稳定的重要基础,大量的研究集中在胰岛素刺激葡萄糖转运的信号转导通路上。胰岛素和运动均促使葡萄糖转运子4转位到细胞膜上,转运更多的葡萄糖进入细胞而调节细胞的葡萄糖摄取量。普遍认为,胰岛素和运动引发的葡萄糖转运机制是完全不同的,胰岛素激发的葡萄糖转运主要依赖于P13K的激活,而运动导致的糖摄取则可能有Ca2+和AMPK的参与。相对于胰岛素,对运动/肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖的机制了解较少。 目前研究运动/肌肉收缩多应用转基因动物,但成本高,操作复杂。而应用培养的细胞株则没有诸多限制,费用较低,并可单独分析细胞内信号转导。 本研究的目的是应用稳定过表达GLUT4myc的能收缩的C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞模型探讨运动/肌肉收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4运输机制中AMPK和CaMKⅡ的作用。 方法： 第一部分确定C2C12GLUT4myc细胞的培养和分化条件。测定此细胞的GLUT4myc转位响应Carbachol刺激的时间曲线,并用Western blot法检测Carbachol对AS160的调节作用。 第二部分测定在Carbacho1刺激下骨骼肌细胞内Ca2+浓度的变化。 第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特异性药物抑制剂存在的条件下,测定收缩刺激GLUT4myc转位,并用Western blot法检测高钾溶液和Carbachol对ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的调节作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收缩刺激GLUT4myc转位中的作用。 结果： 第一部分比较不同浓度Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位,结果显示,C2C12GLUT4myc细胞的GLUT4myc转位对Carbachol的作用呈剂量和时间依赖关系。0.1mM和1mM的Carbachol刺激均增加细胞表面GLUT4myc含量,0min为基础状态,0.1mM Carbachol刺激20min使GLUT4myc转位达最大值,为基础状态的(1.91±0.41)倍(p0.05)；1mM Carbachol刺激10min使GLUT4myc转位达最大值,为基础状态的(2.00±0.14)倍(p0.05)。 第二部分用激光共聚焦显微镜测定在Carbachol和Caffeine刺激下骨骼肌细胞内Ca2+浓度的变化。结果发现1mM Carbachol刺激使胞浆内Ca2+浓度急性上升,然后缓慢下降并长时间维持在一个较高的浓度：0.1mM Carbachol使细胞内Ca2+浓度呈上下波动趋势；1μM Carbachol使细胞内Ca2+急性上升并快速下降,然后维持在基础水平。3mM Caffeine使细胞内Ca2+浓度急性上升,并下降到一定水平后维持；5mM Caffeine使细胞内Ca2+到一较高水平,然后下降,.并呈上下波动趋势。 第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特异性药物抑制剂存在的条件下,测定收缩刺激GLUT4myc转位,并用Western blot法检测高钾溶液和Carbachol对ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的调节作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收缩刺激GLUT4myc转位中的作用。发现：1mM Carbachol刺激20min可增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc转位,10μM的CaMKⅡ抑制剂KN93预孵育30min,可抑制69%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p0.05)。CaMKK抑制剂STO-609预孵育不影响Carbachol刺激的GLUT4myc转位。50μM骨骼肌肌球蛋白ATPase抑制剂(BTS)预孵育30min,可抑制37%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p0.05)。与文献报道的一致,AMPK的抑制剂Compound C(CC)抑制了71%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p0.05)。 Western blot检测细胞裂解液ACCpS79、AMPKpT172、CaMK II pT289、CaMK IpT177。研究结果表明,高钾溶液、Carbachol和Caffeine刺激均能增加C2C12GLUT4myc肌管CaMKⅡ的磷酸化水平；高钾溶液和Carbachol均可显著刺激AMPK的磷酸化,但不影响CaMKK的下游分子CaMKⅠ的磷酸化。AICAR和Carbachol使C2C12GLUT4myc肌管ACC活性增强,AMPK的抑制剂Compound C预先孵育细胞抑制此作用；AICAR和Carbachol均使AMPK活性增强,但Compound C不抑制此作用。BTS抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增强,不抑制AICAR刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增强。 结论： 1.可收缩的C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞的GLUT4myc转位对不同浓度Carbachol作用呈剂量和时间依赖关系；细胞响应Carbachol刺激的收缩作用,GLUT4myc转位到细胞膜。 2. Carbachol和Caffeine刺激均能增加胞内Ca2+水平,最高分别可达基础状态的3.5倍和2.5倍。 3.高钾和Carbachol去极化诱发的收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4myc转位,其信号转导机制不同于胰岛素,参与的信号分子可能涉及AMPK。表明肌肉收缩可替代胰岛素促进骨骼肌摄取葡萄糖。Ca2+敏感的与收缩有关的信号机制不需要CaMKK,可能需要CaMKⅡ。本课题应用研究肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖机制的C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞模型,测定了GLUT4转位对高钾和Carbachol刺激的收缩的响应,探讨了CaMKⅡ和AMPK等信号分子在收缩刺激GLUT4myc转位的信号转导中的作用机制,可为药物研发提供作用靶点,有助于临床干预、改善胰岛素抵抗。
[Abstract]:Muscle is the most important tissue for the use of glucose in animal body, and its glucose metabolism is an important basis for maintaining the stability of the environment in the body. A large number of studies are focused on the signal transduction pathway that insulin stimulates glucose transport. Insulin and exercise promote the translocation of glucose transporter 4 to the cell membrane and transport more glucose into the cell. It is generally believed that the glucose transport mechanism caused by insulin and exercise is completely different. Insulin stimulated glucose transport is mainly dependent on the activation of P13K, while exercise induced glucose uptake may be involved in Ca2+ and AMPK. The mechanism of glucose is less known.
There is a high cost and complex operation in the study of exercise / muscle contraction, but the use of cultured cell lines is not limited, and the cost is low, and the intracellular signal transduction can be analyzed separately.
The purpose of this study is to explore the role of AMPK and CaMK II in the GLUT4 transport mechanism of skeletal muscle cells stimulated by the contractile C2C12GLUT4myc mouse skeletal muscle cell model which is stable over expression of GLUT4myc.
Method锛，

本文编号：1957501