猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-06-04 00:30

  本文选题：肺炎克雷伯菌 + Ⅲ型菌毛　； 参考：《吉林大学》2010年硕士论文

【摘要】： 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是人与动物肠道和呼吸道常见的定植菌种,属于肠杆菌科,是一种条件性致病菌。菌毛是其重要的致病因子之一,与细菌的粘附定植相关,细菌可借助于菌毛尖端的粘附素(Adhesin)对宿主粘膜上皮细胞的粘附作用粘附到宿主组织器官,这是机体致病的首要条件。 本试验以临床分离的猪源肺炎克雷伯菌菌株Kpn4为研究对象,首先通过甘露糖敏感血凝与抵抗血凝试验、PCR鉴定该菌生长表达的菌毛类型为Ⅲ型菌毛,并改良了Ⅲ型菌毛的体外表达条件,后经SephsdexG—100凝胶过滤法、热洗脱法及酸盐沉淀法纯化得到Ⅲ型菌毛蛋白。然后以Kpn4为抗原免疫4～6周龄BALB/C雌性小鼠,运用PEG融合法,经两次细胞融合,以Ⅲ型菌毛蛋白为一抗,通过间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆3次,得到3株可分泌Ⅲ型菌毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3A1、5D8、4F2,并对其效价、亚类、特异性、中和性、稳定性和相对亲和力进行了测定;结果表明制备出的三株稳定分泌肺炎克雷伯菌Kpn4 McAb的杂交瘤细胞株3A1、5D8和4F2腹水效价依次为1∶3.2×106、1∶2.8×105和1∶1.8×105,培养上清效价依次为1∶3002、1∶2119、1∶1769。3A1为IgG2b亚型,5D8和4F2为IgM亚型。三株McAb的相对亲和力为3A15D84F2;特异性测定结果表明,本试验所制备的肺炎克雷伯Ⅲ型菌毛McAb特异性反应显示与大肠埃希菌,副伤寒沙门菌,铜绿假单胞菌,产单核细胞李斯特杆菌,胸膜肺炎放线杆菌均无交叉反应性,具有较好的特异性。稳定性试验显示三株杂交瘤细胞都能稳定分泌Kpn4 McAb的能力。筛选效价高、中和活性好的1株单克隆抗体(3A1),建立双抗夹心ELISA检测方法,建立标准曲线,其标准曲线的回归方程为y =0.4333x -0.2223,最低检测限为62.5ng/mL,最适检测范围为62.5～4000 ng/mL。为该菌的快速诊断、噬菌体文库的展示和阻断菌毛粘附蛋白的作用机制及分子流行病学调查提供基础。
[Abstract]:Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae) is a common colonized bacterium in intestinal tract and respiratory tract of human and animal. It belongs to Enterobacteriaceae and is a kind of conditional pathogenic bacteria. Bacterial pili is one of the important pathogenic factors, which is related to bacterial adhesion and colonization. Bacteria can adhere to host tissues and organs by means of adhesion to host mucosal epithelial cells by means of Adhesin, an adhesin at the tip of pili, which is the most important condition for organism pathogenicity. In this study, the clinical isolates of Klebsiella pneumoniae (Kpn4) were used as the research objects. Firstly, the growth and expression of Klebsiella pneumoniae was identified as type 鈪，

本文编号：1974963