人骨髓干细胞源性恶性转化细胞的靶向清除

发布时间：2018-06-09 13:16

  本文选题：恶性转化 + 靶向清除　； 参考：《重庆大学》2010年博士论文

【摘要】： 背景:人类骨髓干细胞(human bone marrow stem cells, hBMSC)移植给许多病人带来了希望的同时也带来了风险。干细胞治疗所带来的所有风险中,最严重而且最引人注目的是干细胞植入体内后发生恶性转化而致肿瘤的形成。因而制定一个干细胞植入后的可控制策略就成了各干细胞研究团队和临床医学研究者迫在眉睫要解决的问题。然而,制定这样的策略却不可避免地面临着许多挑战,包括高效肿瘤组织特特异性启动子的设计、获取大量hBMSC源性恶转细胞用于启动子的功能验证及体内外细胞毒性实验、恶性转化细胞异种移植成活率较低等。迄今为止仍然没有一个切实可行的方法来预防移入hBMSC发生致瘤性转化。 目的:1.提高端粒酶启动子在hBMSC源性恶性转化细胞靶向转录活性的顺式修饰探讨,获取一种在端粒酶阳性细胞中具有高特异性和较强转录活性的hTERT启动子,为下一步预防干细胞发生恶性转化及靶向清除植入hBMSC源性恶性转化细胞打下基础;2.探寻一个在体外获取足够数量hBMSC源性恶性转化细胞的方法;3.建立一个为预防植入hBMSC发生恶性转化以及靶向清除发生恶性转化研究模型。 方法: 1. c-Myc结合元件对hTERT启动子的修饰:用化学合成方法在野生型hTERT(WThTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入三个E-box序列,构建成修饰型hTERT(Mod1hTERT)启动子;分别用WThTERT和Mod1hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS(端粒酶阴性)、以及人骨髓干细胞(hBMSC)中表达,比较并分析不同启动子在端粒酶阳性与阴性细胞中的表达强度。 2.源于hBMSC的恶性转化细胞的体外扩增:从骨髓中分离培养人骨髓干细胞,并用流式细胞仪进行表型鉴定;然后用慢病毒转染和致瘤化学诱导剂BPDE处理共同诱导骨髓干细胞发生恶性转化;用PALA进行IC50筛选纯化瘤变细胞克隆;最后再用PCR、RT-PCR、Western blot等方法对慢病毒转染、细胞周期调控相关基因表达进行分析。 3.下调hTERT启动子在hBMSC中转录活性的修饰:在Mod1hTERT启动子的上游接入4个骨髓锌指蛋白-2(MZF-2)转录因子结合元件,形成新的修饰型启动子命名为Mod2hTERT启动子;分别从大肠杆菌K12和质粒pEGFP-N3中通过聚合酶链式反应合成胞嘧啶转氨酶(CD)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因;用化学合成法分别制备野生型hTERT、Mod1hTERT及Mod2hTERT启动子;将EGFP和荧光素酶(luciferase)报告基因分别亚克隆入慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOP中;将各启动子片段取代pLenti6/V5-D-TOPO中的CMV启动子片段;将重组慢病毒载体包装成病毒颗粒后转染正常人骨髓间充质干细胞(hBMSC)、慢病毒转染及化学致瘤剂BPDE处理后的人骨髓间充质干细胞(BR-hBMSC) ,以及PALA抗性的BR-hBMSC(PBR-hBMSC);通过荧光相差显微镜观察EGFP表达和荧光素酶分析kit检测荧光素酶活性(luciferase activity)。 4. 5-FC对hBMSC源性恶性转化细胞的细胞毒性实验:分别用不同浓度梯度的5-FC来处理体外培养的转入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod1hTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、CMV-luciferase-IRES-CD及prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD融合基因的各组PBR-hBMSC细胞;用MTT法在体外测定不同浓度梯度5-FC对各组PBR-hBMSC的细胞毒性;转入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、以及CMV-luciferase-IRES-CD的转基因PBR-hBMSC植入裸鼠的皮下一周后,腹腔注射5-FC 53，

本文编号：1999853