轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的研究
发布时间：2018-06-15 20:51
本文选题：巨噬细胞 + 免疫 ； 参考：《南昌大学》2009年博士论文
【摘要】： 第一部分大鼠脾脏巨噬细胞的分离与培养 目的:分离培养并鉴定大鼠脾脏巨噬细胞。 方法:SD大鼠,腹腔注射水合氯醛麻醉,无菌取脾脏,制备成脾脏组织细胞混悬液,裂解脾脏组织细胞混悬液中的红细胞;用RPIM-1640培养基重悬沉淀,接种于一次性塑料培养瓶中,在37℃,50ml·l-1CO2,100%湿度中分别培养1、2、3、6、12、24h,洗涤未贴壁细胞,相差显微镜下分别观察脾脏巨噬细胞的贴壁情况,确定最佳细胞贴壁时间。应用免疫组织化学等方法进行细胞的鉴定;台盼蓝染色鉴定细胞活力,瑞氏染色鉴定细胞纯度。 结果: 1.大鼠脾脏组织经过研磨等处理后,得到大量的脾细胞混悬液,可以满足进一步的分离培养的需要;2.观察贴壁细胞, 1-3h细胞少量贴壁,12h左右的贴壁细胞增多, 24h的贴壁细胞减少。12h是贴壁细胞合适时间; 3.相差显微镜下观察到贴壁培养的脾脏巨噬细胞多为圆形或椭圆形,少数呈梭形或多边形。镜下观察细胞体积较大,细胞膜完整,细胞核清晰可见,胞浆内容物丰富;免疫组织化学结果显示贴壁的脾脏巨噬细胞CD68表达阳性,提示所得的细胞是脾脏巨噬细胞,台盼蓝染色显示细胞活力95%,瑞氏染色鉴定细胞纯度90%。 结论:1分离培养出活力和纯度符合实验要求的大鼠脾脏巨噬细胞;2.贴壁12h是大鼠原代脾脏巨噬细胞的合适贴壁培养时间。 第二部分轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响 目的:探讨轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响。 方法:以始终处于37℃的大鼠原代脾脏巨噬细胞作为对照组,实验组将大鼠原代脾脏巨噬细胞置于41℃恒温箱中,使细胞轻度热应激1h,然后恢复到37℃,分成应激后0min,30min,60min,120min,180min五个亚组组,总共六个组;以吞噬中性红能力(OD540nm值)检测巨噬细胞的吞噬功能、噻唑蓝法测定巨噬细胞对L1210细胞的杀伤作用来反应巨噬细胞的杀伤活性,Transwell小室趋化装置观察巨噬细胞趋化活性变化;采用双抗夹心ABC-ELISA法检测大鼠脾脏巨噬细胞分泌的TNF-a,IL-12浓度的变化。 结果:轻度热应激(41℃、1h)后,实验组大鼠脾脏巨噬细胞的功能均发生了变化,而且与应激后恢复时间有关。热应激后0min,巨噬细胞的OD540nm值由正常的0.21±0.01上升到0.34±0.01(p0.05),然后继续上升,至60min达最高值0.81±0.04(p0.01),随后逐渐下降,应激后180min仍然有0.47±0.03(与对照组比较,p0.05);杀伤活性由正常的35.30±4.37㳠上升到应激后0min的45.00±4.74㳠(p0.05),在60min分钟达到最大值82.07±5.17㳠(p0.01),随后逐渐下降,180min后杀伤活性基本恢复正常,为37.27±5.11㳠(与对照组比较,p0.05);趋化作用也呈现大致相同的变化趋势,大鼠脾脏巨噬细胞正常趋化活性为23.40±5.32/HP;热应激1h后0min为34.60±5.22/HP(p0.05),在60min分钟达到最大值60.80±4.02/HP(p0.01)后逐渐下降,180min仍为31.60±4.21/HP(与对照组比较,p0.05);在实验时间内,大鼠脾脏巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-12均随着应激后时间的延长而增多,180min达到最高(与对照组比较,P 0.01)。 结论:轻度热应激后,大鼠脾脏巨噬细胞的吞噬功能、杀伤活性、趋化活性都有上调;在实验时间内,大鼠脾脏巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-12在轻度热应激后随着时间的延长而增加。提示轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞的免疫功能有促进作用。 第三部分Bip蛋白在轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞中的表达与意义 目的:探讨轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞Bip蛋白的表达及其对细胞功能改变的影响。 方法:原代培养大鼠脾脏巨噬细胞,将细胞置于41℃恒温箱中,使细胞轻度热应激,1h后恢复到37℃,分别检测应激后0min,30min,60min,120min,180min巨噬细胞BipmRNA、Bip蛋白的表达;同时段分别检测巨噬细胞吞噬功能、杀伤活性和趋化作用。 结果:(1)轻度热应激后,大鼠脾脏巨噬细胞BipmRNA的表达明显增加,30min后到达高峰,60min、120min时仍高于对照组(p0.01),180min后恢复至正常水平。Bip蛋白的表达在轻度热应激60min后到达高峰,120min、180min时仍高于对照组(p0.05)。(2)轻度热应激后,大鼠脾脏巨噬细胞的吞噬功能、杀伤活性和趋化作用均明显增强,且与BipmRNA、Bip蛋白表达的改变基本同步。 结论:轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞BipmRNA、Bip蛋白的表达与巨噬细胞功能发生同步改变,提示Bip蛋白表达上调与轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞功能增强可能有关。 第四部分BiP反义寡核苷酸对轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响 目的:探讨Bip反义寡核苷酸对体外轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞功能的影响,进一步证实Bip在轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞功能改变中的作用。 方法:设计特异性Bip寡核苷酸,反义序列为5’- CTTTGTCCTAGCCGCTCG - 3’;错义序列为5’- CTTTGTCCTAGCCGCTCG - 3’。通过脂质体包裹后将其转染至小鼠脾脏巨噬细胞,观察Bip反义寡核苷酸转染后及未转染组、Bip错义寡核苷酸转染后大鼠脾脏巨噬细胞BipmRNA的改变;然后分别观察正常对照组、轻度热应激组和Bip反义寡核苷酸转染并轻度热应激后脾脏巨噬细胞功能的改变。 结果:Bip反义寡核苷酸转染大鼠脾脏巨噬细胞后,与未转染组和错义组比较,轻度热应激后BipmRNA的表达明显减少;大鼠脾脏巨噬细胞吞噬功能、趋化活性和杀伤活性明显回落(P0.01)。 结论:Bip反义寡核苷酸可显著抑制大鼠脾脏巨噬细胞BipmRNA的表达,并可降低轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞吞噬功能、趋化活性和杀伤活性。Bip对轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞的免疫功能有促进作用。 第五部分P38MAPK信号途径在轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能改变中的作用 目的:研究MAPK信号途径在Bip蛋白介导的体外轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能改变中的作用。 方法:P38MAPK抑制剂预处理大鼠脾脏巨噬细胞,将细胞置于41℃恒温箱中,使细胞轻度热应激,1h后恢复到37℃(抑制组),以未应激(对照组)和单纯41℃热应激1h后60min大鼠脾脏巨噬细胞(应激组)为对照,分别检测三组大鼠脾脏巨噬细胞吞噬、杀伤、趋化功能。同时检测P38MAPK蛋白和Bip蛋白的表达。 结果:轻度热应激后60min,应激组大鼠脾脏巨噬细胞吞噬、趋化和杀伤活性增强,与对照组、抑制组比较差异有显著性(P0.01)。P38MAPK抑制剂预处理大鼠脾脏巨噬细胞,与应激组比较,热应激后巨噬细胞吞噬、趋化和杀伤活性明显降低(P0.01),与对照组比较无显著差异(P0.05)。应激组P38MAPK蛋白表达明显上调,与对照组和抑制组比较差异有显著性(P0.01);P38MAPK抑制剂预处理后,抑制组P38MAPK蛋白表达受到抑制,与应激组比较(P0.01)。Bip蛋白的表达也因P38MAPK抑制剂预处理而发生改变,由应激组的1.2702±0.5345(Bip/β-actin)下降到抑制组的1.0281±1.0614(P0.05)。 结论:轻度热应激可增强大鼠巨噬细胞吞噬、趋化和杀伤作用的同时,P38MAPK、Bip蛋白表达上调。P38MAPK抑制剂可显著抑制大鼠巨噬细胞吞噬、趋化和杀伤功能以及P38MAPK、Bip蛋白的表达。P38 MAPK信号途径参与Bip蛋白介导的轻度热应激后大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的调节。
[Abstract]:Isolation and culture of splenic macrophages from the first part of rats
Objective : To isolate and identify splenic macrophages in rats .
Methods : Sprague - Dawley rats were anesthetized by intraperitoneal injection of chloral hydrate , the spleen was sterilized by intraperitoneal injection , red blood cells in the spleen tissue cell suspension were prepared . The cells were incubated at 37 鈩，
本文编号：2023606
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