修饰型GM3树突状细胞疫苗抗白血病免疫效应研究

发布时间：2018-06-23 23:04

  本文选题：修饰型GM3 + 树突状细胞疫苗　； 参考：《第二军医大学》2010年硕士论文

【摘要】： 肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)是肿瘤细胞表面表达最丰富的肿瘤相关抗原,是肿瘤免疫治疗的重要靶标。GM3(monosialoganglioside 3)是N-乙酰基唾液酸-α(2-3)-吡喃型半乳糖-β-(1-4)吡喃型葡萄糖组成的三糖,以糖脂或糖蛋白形式大量表达在白血病等肿瘤细胞表面。由于天然TACAs或从天然TACAs制成的糖合物疫苗免疫原性低,为提高其免疫原性,前期我们用化学合成方法制备了N-苯乙酰基唾液酸取代N-乙酰基唾液酸的修饰型GM3(GM3NPhAc)新抗原,与血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)耦联制成了糖合物疫苗GM3NPhAc -KLH。研究表明,将含有非天然抗原结构的GM3NPhAc KLH免疫小鼠,能有效诱导产生针对新抗原的IgM,IgG1,IgG2a和IgG3多种类型的抗体。 鉴于机体抗肿瘤免疫机制中,细胞免疫比体液免疫发挥着更重要的作用,而GM3NPhAc-KLH主要诱导体液免疫,本研究将高免疫原性GM3NPhAc-KLH与树突状细胞(dendritic cell,DC)强大的抗原提呈功能相结合,制备DC疫苗,来诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应;同时根据细胞内糖链合成是一系列包括唾液酸转移酶在内的酶促反应原理,应用糖生化工程(glycoengineering)的方法,利用N-苯乙酰基甘露糖胺(ManNPhAc)单糖前体促使肿瘤细胞表面合成修饰型的新糖链抗原GM3NPhAc,期望DC疫苗诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应清除肿瘤细胞,为肿瘤治疗提供一种全新的高效、低毒的方法。本研究选择白血病细胞为靶细胞,探讨应用糖生化工程的方法促使白血病细胞表达修饰型GM3新抗原(GM3NPhAc)以及GM3NPhAc-KLH荷载树突状细胞制备的DC疫苗特异性抗白血病作用。 研究结果如下: 1.白血病细胞FBL3与ManNPhAc(0-2 mM)孵育24 h、48 h、72 h, ELISA结果显示ManNPhAc(0.5-2 mM)处理48-72 h显著促进FBL3细胞表面大量表达修饰型抗原GM3NPhAc;FBL3细胞与2 mM ManNPhAc共同孵育72 h后,免疫组化结果显示FBL3细胞表面大量GM3NPhAc特异性染色;接种5×105 FBL3细胞7天的荷瘤小鼠连续7天腹腔注射ManNPhAc,1 mg/只,免疫组化结果显示,肿瘤组织表面能表达大量的GM3NPhAc抗原,而不给予ManNPhAc的对照组小鼠肿瘤细胞则不表达GM3NPhAc抗原,表明糖生化工程的方法能促进白血病细胞表达修饰型GM3NPhAc新抗原; 2.抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)实验结果显示,腹腔巨噬细胞对GM3NPhAc特异性抗体介导的糖生化工程的FBL3细胞细胞毒作用显著增加,FBL3细胞与0.05-0.35 mM GM3NPhAc孵育72 h,GM3NPhAc特异性抗体介导的巨噬细胞对其杀伤作用达到65%-80%;补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)实验结果显示,补体对GM3NPhAc特异性抗体介导的的糖生化工程的FBL3细胞毒作用也显著增加,FBL3细胞与0.15 mM ManNPhAC孵育72 h,补体对其杀伤作用达到100%。提示肿瘤细胞经很小量的修饰型单糖前体处理后,就能表达新的糖抗原,且可被新抗原的单克隆抗体所识别和机体免疫系统杀灭。 3.制备小鼠骨髓来源的DC,流式细胞仪鉴定结果表明DC的纯度较高。培养五天的DC(2×10~6)加入20μg/ml GM3NPhAc-KLH培养过夜制备DC疫苗。 4.将制备的DC疫苗相隔7天免疫C57/Bl6小鼠2次,第二次免疫后一天取血检测抗体,同时制备脾细胞用GM3NPhAc-KLH刺激制备细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)。小鼠血清抗体检测表明,修饰型GM3NPhAc-KLH-DC组的Igκ,IgG明显上升(P0.05),表现出疫苗活性。以表达修饰型GM3的FBL3细胞为靶细胞,以表达天然抗原的FBL3细胞为对照,LDH法观察上述CTL对靶细胞的杀伤作用。结果表明,GM3NPhAc-KLH-DC诱导产生的CTL对经糖生化工程表达修饰型GM3的FBL3细胞的杀伤作用显著高于KLH-DC组,同时也显著高于对FBL3细胞的杀伤作用(P0.05),表明GM3NPhAc-KLH-DC是一个特异性的DC疫苗。 5. DC疫苗相隔7天免疫小鼠2次,d17皮下接种FBL3细胞(5×10~5),次日腹腔注射ManNPhAc溶液,1 mg/只,连续7天,观察肿瘤的生长情况和存活率。结果显示,GM3NPhAc-KLH-DC组小鼠的肿瘤体积小于DC和KLH-DC对照组,且生存期延长。表明GM3NPhAc-KLH-DC疫苗具有抗瘤活性。 结论:GM3NPhAc-KLH-DC疫苗能诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抗瘤活性。DC疫苗结合糖生化工程的方法为高选择性或靶向的肿瘤免疫治疗提供一种全新的方法。
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本文编号：2058818