视黄酸诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

发布时间：2018-06-28 08:48

  本文选题：骨髓间充质干细胞 + 视黄酸　； 参考：《天津科技大学》2010年硕士论文

【摘要】：骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有取材方便、来源广泛、自体移植无免疫排斥性等优点而成为理想的移植细胞。成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,对临床上治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤修复具有重要意义。本研究探讨体外分离培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞的方法,对视黄酸(Retinoic Acid, RA)抑制骨髓间充质干细胞增殖,促进其向神经细胞分化及作用机制进行初步研究。 通过密度梯度离心培养法和完全贴壁培养法,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,证实通过离体培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现数目扩增,发现密度梯度离心法有利于BMSCs的纯化。 不同浓度RA诱导BMSCs,加入碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)优化诱导条件,对其进行形态学观察,MTT法测定细胞存活率,确定RA最佳诱导浓度。RT-PCR及免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定,证实视黄酸诱导BMSCs分化为神经细胞,细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GAFP)和微管相关蛋白-2(MAP-2),同时发现bFGF可以明显提高BMSCs存活率和保护分化后的神经细胞,但是对于BMSCs的分化率无明显作用。 RT-PCR检测RA诱导BMSCs过程中,RA受体RXRa的表达上调,证明RXRa参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。 同时检测到在mRNA水平上转录因子Myocardin和MRTFA的表达升高,证明Myocardin和MRTFA也参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。利用Myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒Myocardin△C,通过竞争性的抑制内源Myocardin的功能,研究Myocardin在RA诱导BMSCs分化为神经细胞中的作用。结果发现,Myocardin功能缺失时,RA诱导效率显著降低,证明RA诱导BMSCs向神经细胞分化过程部分依赖转录因子Myocardin. RT-PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin-El和P21的表达情况。结果显示,在mRNA水平上,细胞周期蛋白cyclin-El的表达下降,P21的表达升高。证明在一定浓度范围内,RA能通过下调细胞周期蛋白Cyclin-El的表达,上调细胞周期抑制蛋白P21的表达,抑制BMSCs的增殖,促进其分化。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have many advantages, such as convenient material selection, wide source, no immune rejection and so on. The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells is of great significance in the treatment of neurodegenerative diseases and the repair of central nervous system injury. The aim of this study was to investigate the method of isolation and purification of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from SD rats in vitro. Retinoic acid (RA) inhibited the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and promoted their differentiation into neural cells. Rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and purified by density gradient centrifugation and complete adherent culture. It was proved that the low abundance BMSCs could be amplified by in vitro culture. It was found that density gradient centrifugation was beneficial to the purification of BMSCs. Different concentrations of RA were used to induce BMSCs, then basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor,) was added to optimize the induction conditions, and the cell survival rate was determined by morphological observation. The best concentration of RA was determined. RT-PCR and immunocytochemistry were used to identify the cells induced by retinoic acid, which confirmed that BMSCs were differentiated into nerve cells by retinoic acid. The cells expressed neuronal specific enolase (NSE), glial fibrillary acidic protein (GAFP) and microtubule-associated protein 2 (MAP-2). However, there was no obvious effect on the differentiation rate of BMSCs. RT-PCR was used to detect the up-regulation of RXRa receptor in RA induced BMSCs, which proved that RXRa was involved in the differentiation of BMSCs into neural cells induced by RA. At the same time, the expression of transcription factors Myocardin and MRTFA were increased at mRNA level, which suggested that Myocardin and MRTFA were also involved in the differentiation of BMSCs into neural cells induced by RA. The role of Myocardin in the differentiation of BMSCs into nerve cells induced by RA was studied by competitive inhibition of endogenous Myocardin using Myocardin deletion transcription activation domain eukaryotic expression plasmid Myocardin C. The results showed that the induction efficiency of RA was significantly decreased in the absence of Myocardin, which indicated that the differentiation process of BMSCs induced by RA was partly dependent on the transcription factor Myocardin.RT-PCR was used to detect the expression of cyclin El and P21. The results showed that the expression of cyclin-El decreased and the expression of P21 increased at mRNA level. The results showed that RA could down-regulate the expression of cyclin-El, up-regulate the expression of cell cycle inhibitor protein P21, inhibit the proliferation of BMSCs and promote the differentiation of BMSCs.
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

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