幽门螺杆菌cag致病岛中cagL基因的鉴定与分析

发布时间：2018-07-03 08:08

  本文选题：幽门螺杆菌 + 原核表达　； 参考：《江苏大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的:克隆并鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637cagL编码基因;原核表达并纯化CagL融合蛋白;观察其融合蛋白对细胞株GES-1表达IL-8 mRNA能力的影响,并探讨cagL基因在H.pylori cag致病岛(cagpathogenicity island,cag PAI)编码的Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system,TFSS)中的作用,为进一步阐明H.pylori的致病机制奠定基础。 方法: 1.根据GenBank收录的H.pylori 22695全基因组序列,设计扩增cagL基因的引物,利用PCR技术从H.pylori NCTC 11637基因组DNA中扩增获取cagL基因,T-A克隆后进行序列测定;并对其序列进行生物信息学分析研究; 2.构建PET-28a(+)-cagL原核表达载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导阳性菌株表达后,SDS-PAGE法和Western Blot法鉴定目的蛋白,并用Ni~(2+)-NTA树脂分离纯化所表达的CagL融合蛋白; 3.将融合蛋白CagL与弗氏佐剂充分乳化后,免疫家兔,制备抗CagL多克隆抗体;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中抗体效价; 4.不同浓度的融合蛋白CagL与GES-1细胞作用一定时间后,提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-8 mRNA的表达; 5.收集H.pylori,重悬并裂解菌体,经高速离心分离得到各菌体组分蛋白,包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及内外膜蛋白;利用Western Blot法检测CagL蛋白的亚细胞定位; 6.将制备的CagL多克隆抗体按不同比例与幽门螺杆菌共孵育后,分别加入至细胞GES-1中,作用一定时间后;Western Blot法检测细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)在抗体中和前后转运的影响; 结果: 1.PCR扩增获得的cagL基因全长为654 bp,编码217aa,(申请GenBank的登录号为GU937872)与GenBank公布的其它H.pylori菌株的基因序列同源性为96%～98%,氨基酸同源性为97%～99%,蛋白的相对分子质量Mr约为32KDa,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域。 2.成功构建了PET-28a(+)-cagL原核表达载体,确定IPTG终浓度1mmol/L,温度30℃,诱导时间4h为最佳诱导条件,经SDS-PAGE及Western Blot法鉴定有目的蛋白表达;通过Ni~(2+)-NTA树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的CagL融合蛋白。 3.获得CagL融合蛋白多克隆抗体,效价为1:3.2×10~5。 4.CagL融合蛋白可诱导细胞GES-1表达IL-8 mRNA,并且该效应呈浓度依赖性。 5.Western Blot结果显示CagL蛋白定位于菌体内外膜;经CagL多克隆抗体中和作用后,其菌体转运CagA的蛋白量随抗体量的增加而逐渐降低,表明抗体中和作用后能够抑制CagA蛋白的转运。 结论: 本研究通过克隆表达cagL基因,获得CagL融合蛋白;并且证实CagL可诱导细胞株GES-1表达IL-8 mRNA,该效应呈浓度依赖性;CagL蛋白定位于菌体内外膜,通过制备的CagL多克隆抗体中和作用后可抑制CagA蛋白的转运。
[Abstract]:Objective: to clone and identify the encoding gene of Helicobacter pylori (H.pylori) NCTC 11637 cagL, express and purify CagL fusion protein in prokaryotic, and observe the effect of the fusion protein on the expression of IL-8 mRNA in cell line GES-1. To investigate the role of cagL gene in type 鈪，

本文编号：2092980