小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体构建及其对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用

发布时间：2018-07-03 13:16

本文选题：HSP10 + 腺病毒载体　；参考：《南京医科大学》2009年硕士论文

【摘要】：目的:热休克蛋白10(heat shock protein 10,HSP10)又称CPN10、GROES或HSPE1,属于小分子热休克蛋白家族成员,主要作为一种分子伴侣蛋白,与HSP60协同,在蛋白质折叠中发挥作用;HSP10还参与细胞周期调控、核质运输和新陈代谢。我们的前期研究发现,HSP10蛋白水平在多囊卵巢综合征患者卵巢组织中的表达明显低于正常人卵巢组织。但是,有关HSP10蛋白在多囊卵巢综合征发生发展过程中的作用尚未有过报道。本研究通过构建小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体及体外培养小鼠卵巢颗粒细胞,实现HSP10基因在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达抑制和超表达;观察改变HSP10基因表达后卵巢颗粒细胞的凋亡。通过该研究,探讨HSP10在卵巢颗粒细胞中的生理功能,并为研究HSP10在多囊卵巢综合征病理生理机制中的作用提供依据。方法: (1)根据siRNA靶序列设计2条互补的64bp寡核苷酸,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA,再与穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接,构建穿梭质粒pATC-H1-siRNA。pATC-H1-siRNA经酶切和测序鉴定后,通过“两步转化法”分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pATC-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到AdCMV-H1-siRNA/HSP10重组腺病毒质粒。继而通过脂质体转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。AdCMV-H1-siRNA/HSP10转染AD-293细胞收集的病毒上清,重复感染AD-293细胞四次,实现病毒大量扩增。(2)用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增HSP10基因全长,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-HSP10。分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pAdTrack-HSP10转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到AdCMV-HSP10重组腺病毒质粒。通过脂质体转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。转染后用收集的病毒上清重复感染细胞,实现病毒大量扩增。(3)每只标准克小鼠腹腔注射PMSG48小时后,取出双侧卵巢,获得卵母细胞核卵丘细胞,加入透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离,以相同密度接种入6孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱中。(4)将AdCMV-H1-siRNA/HSP10及AdCMV-HSP10重组腺病毒直接加入培养液中感染小鼠卵巢颗粒细胞。病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞48小时后分别提取蛋白,通过Western blot的方法验证HSP10在颗粒细胞中的表达抑制和超表达,应用流式细胞术、TUNEL法检测颗粒细胞的细胞凋亡。结果: (1)穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切与测序证实构建成功,进一步与pAdTrack-CMV连接,构建穿梭质粒pATC-H1-siRNA,构建成功了HSP10基因的siRNA重组腺病毒质粒pAdCMV-H1-siRNA/HSP10和对照质粒pAdCMVH1-siRNA/control。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组病毒,以GFP为标志测定AdCMV-H1-siRNA/HSP10病毒滴度为109 U/ml,AdCMVH1-siRNA/control病毒滴度为108 U/ml。(2)从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的cDNA,测序证实为小鼠HSP10基因。在此基础上,通过BJ-5183细菌内同源重组的方法构建了HSP10基因的重组腺病毒质粒AdCMV-HSP10及对照质粒AdCMV。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组病毒,以GFP为标志测定AdCMV-HSP10病毒滴度为107 U/ml,AdCMV-GFP病毒滴度为108 U/ml。(3)成功进行了小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养,实现了HSP10在小鼠卵巢颗粒细胞内表达抑制和超表达。与对照组相比,在HSP10表达抑制组中蛋白的表达水平明显降低,两组间差异显著(p0.05)。同时,与对照组相比,在HSP10超表达组中蛋白的表达水平明显升高,两组间差异显著(p0.05)。(4)用细胞流式术、TUNEL法检测了HSP10表达抑制和超表达后颗粒细胞的细胞凋亡,结果显示:与对照组相比,表达抑制组中细胞凋亡率明显增加,两组间差异显著(p0.05);超表达后,颗粒细胞的细胞凋亡明显减少,两组间差异显著(p0.05)。结论:(1)小鼠HSP10基因siRNA和超表达重组腺病毒载体的构建为进一步研究HSP10在PCOS发生发展中的作用及其机制提供了实验基础。(2)HSP10在小鼠颗粒细胞内表达抑制后明显促进了细胞的凋亡;超表达后颗粒细胞的细胞凋亡明显减少。表明HSP10与颗粒细胞凋亡的生理机制相关。(3)从课题组前期结果和本文结果推论,在PCOS发生发展中卵巢HSP10表达降低,进而诱导了颗粒细胞的凋亡。
[Abstract]:Objective : Heat shock protein 10 ( HSP10 ) , also known as CPN10 , GROES , or HSPE1 , is a member of small molecular heat shock protein family . It plays a role in protein folding . HSP10 plays a role in cell cycle regulation , nuclear transport and metabolism .

Methods : ( 1 ) The recombinant adenovirus vector of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 was cloned into BJ - 5183 competent bacteria . The recombinant adenovirus vector pAdTrack - H1 - siRNA / HSP10 was transformed into BJ - 5183 competent bacteria to obtain AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 recombinant adenovirus plasmid . The recombinant adenovirus of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and AdCMV - HSP10 was transfected into BJ - 5183 competent bacteria .

Results : ( 1 ) The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed successfully . The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed .

Conclusion : ( 1 ) The construction of HSP10 siRNA and overexpression recombinant adenovirus vector provides an experimental basis for further studying the role and mechanism of HSP10 in the development of PCOS .
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【参考文献】