【摘要】： 第一部分晚期内体／溶酶体定位的小G蛋白Rab7b抑制巨噬细胞TLR9刺激产生的促炎性因子和Ⅰ型干扰素 大量研究证明,TLR9的异常活化参与了多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等的发病过程,。基于上述研究事实,TLR9拮抗剂有望成为这些自身免疫性疾病防治的潜在靶点。为此,必须对于TLR9受体介导的效应与相关信号转导机制了解清楚,同时,发现并鉴定TLR9信号通路新的负向调控因子也具有十分重要的意义。众所周知,TLR9被活化后最终将被转运到晚期内体／溶酶体中,但是对于TLR9在细胞中的这一重新定位过程到底有何生物学重要意义,目前还不十分清楚。Rab7b是本实验室从人树突状细胞cDNA文库中通过随机大规模测序得到的一个与Rab7高度同源的新型分子,因此命名为Rab7b。Rab7b是一类鸟苷三磷酸酶,其主要定位在细胞的晚期内体和溶酶体中。本实验室之前的研究表明,Rab7b通过促进TLR4的溶酶体途径降解以负向调节TLR4信号通路。在本研究中,我们发现在巨噬细胞中TLR9的交联可以通过ERK和p38途径有效地抑制Rab7b的表达。相反,晚期内体／溶酶体定位的Rab7b在细胞内可以与TLR9共定位在溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)阳性的细胞器室内,Rab7b对于MyD88以及其下游信号并不存在调控效应,但是当TLR9被活化后Rab7b通过直接促进TLR9本身的溶酶体途径降解的翻译后修饰下调TLR9在巨噬细胞中的表达。相应的,Rab7b抑制TLR9下游的MAPK和NF-κB等转录因子的活性进而负向调节TLR9诱导的TNF-α,IL-6等促炎性因子和IFN-β为代表的Ⅰ型干扰素的产生。本研究结果提示,Rab7b通过促进TLR9本身的降解从而抑制TLR9信号通路中多种信号分子和转录因子的活性,抑制由TLR9诱导的促炎性因子和Ⅰ型干扰素的产生。该结果对于进一步深入研究TLR9触发的生物效应与相关信号通路的调控机制提高了新的线索和实验基础。 第二部分凋亡诱导蛋白LAPF负向调控TLR3和TLR9介导的促炎性因子和Ⅰ型干扰素产生的效应与机制研究 TLRs家族受体根据各自不同的亚细胞定位可以分成细胞膜表面的TLRs和细胞内定位的TLRs两大类。TLRs成员的不同空间分布可能存在一种与它们空间定位相关的调控新模式,为TLRs信号调控的机制研究提供了新的方向。本实验之前我们从人树突状细胞cDNA文库中通过随机大规模测序发现了的溶酶体相关的包含PH和FYVE结构域的凋亡诱导蛋白LAPF并报道了其参与TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡过程。LAPF与细胞内定位的TLRs成员相近的亚细胞定位使我们考虑是否存在LAPF参与胞内定位TLRs信号调控的可能。结果发现,LAPF可以负向调控巨噬细胞中胞内定位的TLR3和TLR9的信号通路,但却不能调控细胞膜定位的TLR4信号通路。小鼠原代巨噬细胞中过表达LAPF可以抑制TLR3和TLR9介导的TNF-α,IL-6和IFN-β的产生,LAPF的这种负向调控效应部分依赖于其包含的PH结构域。不仅仅是细胞内定位的TLRs,胞内dsRNA识别受体RIG-I同样受到LAPF的调控。由RIG-I介导识别的仙台病毒感染巨噬细胞所产生的IFN-β也同样被LAPF所抑制。荧光差异双向凝胶电泳以及后续的蛋白质谱分析实验发现,过表达LAPF降低了细胞内Calmodulin的总蛋白表达量。Calmodulin是细胞内最重要的Ca2+结合蛋白,可以活化下游CamKII,而CaMKII在本实验室之前的工作中已经被证明是TLRs信号完全活化所必须的。此外,LAPF也可以通过其PH结构域与磷酸化的Akt相互结合从而促进Akt的磷酸化。Akt的活化可以磷酸化下游底物GSK-3位于N-末端的抑制性丝氨酸磷酸化位点,从而抑制GSK-3的活性。GSK-3活性被抑制后竞争性地削弱了NF-κB依赖的促炎性因子的产生。因此,与TLR3和TLR9有相同亚细胞定位的LAPF通过下调细胞内Calmodulin的表达量以及活化Akt/GSK-3信号通路从而负向调控TLR3／9介导的促炎性因子和Ⅰ型干扰素的产生。该部分研究结果为细胞内定位的TLR信号通路调控的分子机制的研究提供了新的认识。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392
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本文编号：2333151
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