皮质酮对小鼠海马HT-22细胞游离锌含量的影响及其机制探讨

发布时间：2017-03-27 15:12

  本文关键词：皮质酮对小鼠海马HT-22细胞游离锌含量的影响及其机制探讨，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 面对复杂而多变的生存环境，机体经常处于一种应激状态，对应激源产生着适应性和防御性的非特异性反应。给予任何外源性的生物应激，机体都能产生非特异性反应以恢复内环境的稳定性。糖皮质激素(Glucocorticoids, GC)是重要的应激激素，机体在发生应激反应时，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)，大量分泌该激素。在小鼠体内，主要的应激激素是皮质酮(Corticosterone, CORT)，机体在应激时，由肾上腺皮质细胞大量分泌该激素。 海马作为中枢神经系统内调节应激反应的关键脑区，一方面与学习和记忆功能密切相关，另一方面海马比其他脑区集中了更高浓度的糖皮质激素受体，因此是对应激特别敏感、易受应激损伤的脑区。海马齿状回颗粒细胞苔藓纤维终末突触小泡内聚集大量的锌离子，作为神经调质与神经递质共同释放到突触间隙，调节细胞的信号识别、第二信使代谢、蛋白激酶和蛋白磷酸酶活化，并且锌离子可能激活或抑制转录因子的活化，发挥重要生理功能。 锌对于所有机体都是必需的，由于锌的催化性和结构功能使其在很多酶类和蛋白质中检测到，锌相比其他过渡金属元素，有更广泛的功能，如锌离子具有重要的信号调节作用。锌离子是脑内含量最丰富的阳离子之一，多数以结合形式存在，仅有一小部分以游离态存在于神经元内，主要存在于兴奋性含锌神经元轴突终末。细胞内锌稳态对病理生理环境因素的改变非常敏感，在应激状态下，检测到多种细胞游离锌离子显著增加。锌的重要功能使锌缺乏与机体的多种功能紊乱相关，但另一方面过量的锌对细胞也会产生毒性作用，细胞内游离锌离子过度增加可能改变细胞内的氧化状态，还可能引起线粒体功能障碍，导致细胞坏死或凋亡。 我们推测：微量元素锌在应激过程中可能具有重要作用。应激导致细胞锌稳态变化，影响细胞内锌的重新分布，导致胞内游离锌浓度上升，使锌在胞内产生毒性作用，造成细胞氧化状态的改变。 实验目的 本研究通过观察皮质酮对小鼠海马神经元HT-22细胞游离锌含量的变化规律，并对上述变化的可能机制进行探讨，并检测其对细胞活性和ROS水平、ATP水平的影响，不仅有助于了解糖皮质激素在应激过程中对神经细胞内游离锌水平的影响，而且在此基础上为研究应激相关疾病提供实验依据和理论参考。 实验方法 1、细胞培养与处理 HT-22细胞，是小鼠海马细胞系神经元细胞株，由加拿大沙克研究所David Schubert博士馈赠。使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2的条件下培养细胞。进行细胞分化时弃去上述培养液，加入含1×N2的Neuro Basal培养液继续培养24h。 分别采用10μΜ浓度CORT不同时间(0h、3h、6h、12h、24h)和不同浓度CORT(500nM、1μΜ、10μΜ、50μΜ)处理HT-22细胞6h。 2、HT-22细胞游离锌含量的测定 收集细胞后使用含1mM Fluozin-3-AM的HBSS培养液避光孵育HT-22细胞30min，采用流式细胞仪在激发波长488nm下测定HT-22细胞内Fluozin-3-AM荧光强度。 3、HT-22细胞总锌含量的测定 收集细胞后加入100μl的浓硝酸在80℃条件下消化HT-22细胞，待液体蒸干后，加入50μl的浓硝酸溶解残留物，然后用Milli-Q水定容至2ml，采用原子吸收分光光度计火焰法测定胞内总锌含量。 4、HT-22细胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表达量的测定 采用实时定量荧光PCR法测定HT-22细胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA的表达水平。 5、HT-22细胞活性的测定 采用CCK-8试剂盒检测HT-22细胞活性。 6、HT-22细胞ROS水平的测定 采用ROS试剂盒测定HT-22细胞活性氧水平。 7、HT-22细胞ATP水平的测定 采用ATP检测试剂盒测定HT-22细胞ATP水平。 8、统计方法 使用统计软件SPSS16.0进行统计分析，进行数据汇总及绘图使用Excel2007软件，检验水准选择α=0.05；采用两样本t检验和one-way ANVOA、Dunnett’s、Newman-Keuls进行多样本间比较。 实验结果 1、CORT对HT-22细胞游离锌含量的影响 实验结果显示，10μΜ CORT处理HT-22细胞不同时间，与对照组相比，6h、12h组游离锌含量升高，差异有统计学意义(P0.05)。不同浓度CORT处理HT-22细胞6h，与对照组相比，10μΜ CORT组游离锌含量升高，且差异有统计学意义(P0.05)。先加入糖皮质激素受体阻断剂RU4860.5h，再加入CORT处理HT-22细胞，与对照组相比，不能引起胞内游离锌含量升高。 2、CORT对HT-22细胞总锌含量的影响 实验结果显示，与对照组相比，单纯CORT组胞内总锌含量下降，差异有统计学意义(P0.05)。加入RU486组总锌含量与对照组无明显变化。 3、硫酸锌对CORT处理的HT-22细胞游离锌含量的影响 实验结果显示，与对照组相比，单独加入硫酸锌后，胞内游离锌含量显著升高，差异有统计学意义(P0.01)；与CORT组相比，加入硫酸锌+CORT后，胞内游离锌含量显著升高，差异有统计学意义(P0.01)。 4、锌离子螯合剂对CORT处理的HT-22细胞游离锌含量的影响 （1）DTPA对CORT处理的HT-22细胞游离锌含量的影响 实验结果显示，与对照组相比，DTPA组胞内游离锌含量没有明显变化(P0.05)；与CORT组相比，DTPA+CORT组胞内游离锌含量有所降低，但是差异没有统计学意义(P0.05)。 （2）TPEN对CORT处理的HT-22细胞游离锌含量的影响 实验结果显示，与对照组相比，TPEN组胞内游离锌含量显著降低，差异有统计学意义(P0.01)。与CORT组相比，TPEN+CORT组胞内游离锌含量显著降低，差异有统计学意义(P0.01)。 5、CORT对HT-22细胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表达水平的影响 荧光实时定量PCR实验结果显示，与对照组比较，10μΜ CORT处理HT-22细胞6h后，细胞内MT1、MT3mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P0.05)；锌转运体ZIP1、ZnT1和ZnT3mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P0.05)。 6、CORT处理HT-22细胞后对细胞活性的影响 实验结果显示，与对照组相比，不同浓度CORT处理6h，10μΜ组细胞活性无明显变化(P0.05)，50μΜ组细胞活性减弱，差异有统计学意义(P0.05)。同一浓度CORT10μM处理HT-22细胞不同时间，6h组细胞活性无明显变化(P0.05)，12h、24h组细胞活性减弱，差异有统计学意义(P0.05)。 7、CORT处理HT-22细胞后对细胞ROS水平的影响 实验结果显示，与对照组相比，10μΜ CORT处理HT-22细胞6h后细胞活性氧水平升高，差异有统计学意义(P0.01)；与CORT组相比，TPEN+CORT组细胞活性氧水平降低，差异有统计学意义(P0.01)；与对照组相比，硫酸锌组细胞活性氧水平升高(P0.01)；与硫酸锌组相比，硫酸锌+CORT组细胞活性氧水平明显升高，差异有统计学意义(P0.01)。 8、CORT处理HT-22细胞后对细胞ATP水平的影响 实验结果显示，与对照组相比，10μΜ CORT处理HT-22细胞6h后ATP水平降低，差异有统计学意义(P0.01)；与CORT组相比，TPEN+CORT组细胞ATP水平升高，差异有统计学意义(P0.01)；与对照组相比，硫酸锌组细胞ATP水平降低(P0.01)；与硫酸锌组相比，硫酸锌+CORT组细胞ATP水平明显降低，差异有统计学意义(P0.01)。 结论 本研究通过CORT刺激HT-22细胞，观察应激情况下的细胞内游离锌含量变化及通过添加硫酸锌与锌离子螯合剂、荧光实时定量PCR对游离锌变化的机制进行探讨，并进一步观察CORT对HT-22细胞活性及ROS水平、ATP水平的影响。主要结论如下： 1、CORT刺激可以导致HT-22细胞游离锌水平升高。 2、CORT使胞内游离锌含量增加可能主要是因为CORT促进胞内结合态的锌释放。 3、CORT使HT-22细胞内结合态锌解离释放出大量游离锌，导致MT和锌转运体的表达发生变化，使释放到胞外的锌离子增加，总锌含量降低。 4、CORT刺激HT-22细胞，使胞内游离锌含量升高，导致细胞ROS水平升高，ATP水平降低，可能对线粒体的功能造成影响。
【关键词】：皮质酮 海马 HT-22细胞 游离锌 应激
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-10
• Abstract10-16
• 英文缩略词表16-17
• 前言17-20
• 参考文献18-20
• 第一部分 CORT 对 HT-22 细胞游离锌含量的影响20-32
• 一、材料与方法20-25
• 二、实验结果25-29
• 三、讨论29-30
• 四、小结30
• 参考文献30-32
• 第二部分 CORT 对 HT-22 细胞游离锌含量变化的机制探讨32-47
• 一、材料方法32-36
• 二、实验结果36-42
• 三、讨论42-45
• 四、小结45
• 参考文献45-47
• 第三部分 CORT 对 HT-22 细胞活性、ROS 水平及 ATP 水平的影响47-59
• 一、材料与方法47-50
• 二、实验结果50-54
• 三、讨论54-56
• 四、小结56
• 参考文献56-59
• 全文总结59-60
• 综述60-67
• 参考文献64-67
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况67-68
• 致谢68

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨柳;周月琴;张敏;;Zn~(2+)结合相关基因在耐药性癫痫患者颞叶组织中的表达[J];重庆医学;2012年08期

2 王全溪;邵良平;林树根;李国平;;日粮锌水平对雏番鸭免疫器官中细胞凋亡及Fas表达的影响[J];动物营养学报;2008年05期

3 闵兆晗;徐卫东;;参麦注射液、大剂量维生素C及葡萄糖酸锌治疗小儿病毒性心肌炎的疗效[J];临床医学;2010年11期

4 侯伟鹏;孙广信;;黄芪注射液、葡萄糖酸锌联合佐治小儿病毒性心肌炎的临床观察[J];儿科药学杂志;2007年05期

5 杨安博;徐助雄;吴婧;冯玉英;王炳祥;;1-乙酰基-3-(2-羟基-4,6-二甲氧基苯基)-5-苯基-2-吡唑啉的合成及锌离子探针的研究[J];高等学校化学学报;2010年07期

6 颜利求,朱学良;缺锌—动脉粥样硬化形成的危险因素[J];国外医学(医学地理分册);2005年01期

7 颜利求,朱学良;缺锌——动脉粥样硬化形成的危险因素[J];国外医学.心血管疾病分册;2005年01期

8 曾庆祝;陈陆欣;;多肽-锌配合物的生物功能活性及安全性[J];现代食品科技;2013年08期

9 齐红梅;刘微娜;季浏;;运动抗抑郁的神经生物学机制综述[J];首都体育学院学报;2013年05期

10 润袁敏;饶绘;;微量元素锌、铜异常与小儿癫痫临床症状的关系[J];国际检验医学杂志;2014年03期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 宋芳娇;曾克武;屠鹏飞;王学美;;加味五子衍宗方及其活性部位抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应及机制研究[A];第十一届全国博士生学术年会（生物医药专题）论文集（下册，，墙报P25-P48）[C];2013年

2 赵文杰;宋群;王燕虹;李柯锦;茅力;胡忻;练鸿振;郑伟娟;华子春;;A549细胞的锌刺激响应蛋白组表达图谱和MTF-1调节蛋白表达的时间依赖性研究[A];第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨亮;铜绿假单胞菌中RND外排泵基因表达调节和功能研究[D];西北大学;2010年

2 庄秀园;沙棘籽渣黄酮对糖基化终产物抑制作用研究[D];华东师范大学;2011年

3 刘宝英;锌转运体8多克隆抗体的制备及功能初步研究[D];第三军医大学;2010年

4 郑华川;胃癌侵袭转移相关因素的研究[D];中国医科大学;2004年

5 虞泽鹏;锌及锌源对动物的生长、免疫调节及其分子机制研究[D];江南大学;2005年

6 樊江莉;二（2-吡啶甲基）胺为识别基团Zn～（2+）荧光分子探针的研究[D];大连理工大学;2005年

7 徐兆超;基于ICT萘酰亚胺阳离子比率荧光探针的研究[D];大连理工大学;2006年

8 马飞煜;金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠保护机制的研究[D];吉林大学;2007年

9 张宇;基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究[D];大连理工大学;2009年

10 马晓黎;HDAC抑制剂抗肿瘤效应靶基因的研究[D];华中科技大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 崔艳琴;酰胺型荧光小分子的设计、合成及其对金属离子的识别研究[D];辽宁师范大学;2011年

2 杨柳;锌离子结合相关基因mRNA在耐药性癫痫患者颞叶组织中的表达[D];重庆医科大学;2011年

3 王瑞敏;Zn~(2+)及ClO~-传感器的制备及其应用研究[D];华南理工大学;2011年

4 范东艳;硫酸锌拮抗紫外线氧化损伤作用的研究[D];吉林大学;2007年

5 曹莹;防风有效成份抗动脉粥样硬化炎性反应的实验研究[D];中国中医科学院;2007年

6 唐友云;基于IR-780荧光团的Zn～（2+）近红外荧光探针研究[D];湖南大学;2007年

7 芦伟;肺癌患者体液及组织内微量元素检测及其临床意义的研究[D];中国医科大学;2008年

8 吴庆;砷中毒对小鼠脂代谢和细胞凋亡因子的影响及锌拮抗作用的研究[D];新疆医科大学;2008年

9 陆伟红;有机荧光分子的合成、表征及离子识别研究[D];苏州大学;2008年

10 柳佳伟;锌对耐力训练、力竭运动大鼠抗氧化系统的影响[D];华东师范大学;2008年

  本文关键词：皮质酮对小鼠海马HT-22细胞游离锌含量的影响及其机制探讨，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：270586