人Scn5a基因及PRKAG2基因质粒共转染HEK293T细胞模型建立

发布时间：2017-03-27 17:10

  本文关键词：人Scn5a基因及PRKAG2基因质粒共转染HEK293T细胞模型建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 PRKAG2基因编码单磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosinemonophosphate activated protein kinase，AMPK）的γ2亚基，，AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于身体各个组织与细胞中，也包括心脏组织。由于PRKAG2基因突变可导致AMPK功能障碍，而引起一系列的心脏疾病，因而将这类疾病命名为PRKAG2心脏综合征。这是一种常染色体显性遗传性心脏病，是由于编码AMPK γ2亚基的PRKAG2基因发生了点突变而导致的心脏疾病，主要表现为家族性的心肌肥厚、心室预激和心肌糖原沉积。目前国外共发现了17个PRKAG2心脏综合征的家系，并对其进行了基因分析，共发现了11种基因突变，其中包括1种移码突变和10种错义突变，并且发现所有突变位点的均位于cystathionine-β-synthase（CBS）功能区域内。2007年由本实验室首次报道了一个国内患有PRKAG2心脏综合征的家系，并对其进行了基因分析，发现了一个新的PRKAG2突变位点——glycolamine (100) to serine（G100S），令我们感兴趣的是这个位点区别于国外之前报道的所有突变位点，它位于非CBS区域，而CBS区域基因测序完全正常，本实验室对这个新的突变位点进行了进一步的研究，拟揭示汉族人PRKAG2心脏综合征的发病机制。经过前期研究发现，PRKAG2的G100S突变位点导致AMPK的活性改变；动物实验发现，AMPKγ2亚基的突变体可导致CCL细胞及斑马鱼心肌细胞糖原沉积及心肌肥厚，这与国外研究发现结果一致，因而本实验将进一步研究PRKAG2的G100S突变在PRKAG2心脏综合征心律失常发生中的作用机制。 目的 本实验将人心肌细胞钠离子通道（Scn5a）分别与人PRKAG2基因野生型、R302Q突变体及G100S突变体共转染HEK293T细胞，为今后研究PRKAG2基因突变对心肌细胞钠离子通道的影响奠定基础。 方法 1.人PRKAG2基因野生型、R302Q突变体及G100S突变体过表达载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2的构建及HEK293T细胞转染； 2.人Scn5a过表达载体Pcdh-GFP-Scn5a的构建及HEK293T细胞转染； 3.人Scn5a过表达载体Pcdh-GFP-Scn5a分别与人PRKAG2基因野生型、R302Q突变体及G100S突变体过表达载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2共转HEK293T细胞；通过PCR技术、电泳、基因测序检测载体构建结果，通过real time PCR、western blot、免疫荧光检测检测HEK293T细胞转染结果。 结果 1.成功构建人PRKAG2基因野生型、R302Q突变体及G100S突变体过表达载体及完成HEK293T细胞的转染。 （1）PRKAG2基因野生型过表达质粒p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2基因测序结果与人PRKAG2基因CDS序列一致。 （2）PRKAG2基因野生型过表达载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2转染HEK293T细胞48小时后，经过细胞免疫荧光染色后，可在荧光显微镜下看到红色荧光；细胞提取总RNA进行real time PCR验证，转染组RNA表达量明显高于对照组；收细胞提取总蛋白进行western blot验证，转染组蛋白质表达量明显高于对照组。 （3）R302Q突变体及G100S突变体质粒测序，测序结果与预期突变结果一致。 2.成功构建人Scn5a过表达载体pCDH-GFP-Scn5a及转染HEK293T细胞。 （1）过表达质粒Pcdh-GFP-Scn5a基因测序与人Scn5a基因CDS序列一致。 （2）过表达质粒Pcdh-GFP-Scn5a转染HEK293T细胞48小时后，荧光显微镜观察细胞可看到绿色荧光；细胞提取总RNA进行real time PCR验证，转染组RNA表达量明显高于对照组；细胞提取总蛋白进行western blot验证，转染组蛋白质表达量高于对照组。 3.成功完成人Scn5a过表达载体Pcdh-GFP-Scn5a分别与人PRKAG2基因野生型、R302Q突变体及G100S突变体共转HEK293T细胞。 （1）细胞免疫荧光染色验证，FLAG及GFP标签均表达，分别显示出红色荧光和绿色荧光。 （2）共转染HEK293T细胞，48h后收细胞提取总RNA进行Real time PCR验证，Scn5a基因转录RNA在单独转染Scn5a组、Scn5a和PRKAG2基因野生型共转组、Scn5a和R302Q突变体共转组、Scn5a和G100S突变体共转组均可检测到，而在空白对照组为检测到；PRKAG2基因转录RNA在Scn5a和PRKAG2基因野生型共转组含量高，而在Scn5a组、Scn5a和R302Q突变体共转组、Scn5a和G100S突变体共转组含量较低。 （3）共转染HEK293T细胞48h后收细胞提取总蛋白进行Western blot验证，Scn5a基因在单独转染Scn5a组、Scn5a和野生型共转组、Scn5a和R302Q突变体共转组、Scn5a和G100S突变体共转组均有表达，而在空白对照组没表达；PRKAG2基因在Scn5a和野生型PRKAG2共转组高表达，而在Scn5a组、Scn5a和R302Q突变体共转组、和G100S突变体共转组表达量较低。 结论 本课题成功构建了人PRKAG2野生型、R302Q突变体及G100S突变体的过表达载体，同时成功构建了人Scn5a的过表达载体，并且完成了人Scn5a分别与人PRKAG2野生型、R302Q突变体及G100S突变体共转入HEK293T细胞内，为进一步研究PRKAG2R302Q突变体及G100S突变体对心肌细胞钠离子通道的影响奠定基础。
【关键词】：单磷酸腺苷活化的蛋白激酶 突变 心肌细胞钠离子通道 共转染
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 英文缩略词10-12
• 前言12-14
• 第一部分 人 PRKAG2 基因野生型过表达质粒载体p3×FLAGCMV7.1PRKAG2 的构建、R302Q 及 G100S 突变体的过表达载体构建及人 PRKAG2 基因野生型 HEK293T 细胞转染14-39
• 一、材料14-16
• 二、方法16-27
• 三、结果27-39
• 第二部分 人 Scn5a 过表达载体 PcdhGFPScn5a 构建及 HEK 293T 细胞转染39-59
• 一、材料39-41
• 二、方法41-50
• 三、结果50-59
• 第三部分 人 Scn5a 过表达载体 PcdhGFPScn5a 分别与野生型人 PRKAG2 过表达载体 p3×FLAGCMV7.1 PRKAG2、R302Q 突变体及 G100S 突变体共转 HEK293T 细胞59-72
• 一、材料59-60
• 二、方法60-66
• 三、结果66-72
• 讨论72-73
• 小结73-74
• 参考文献74-77
• 全文总结77-78
• 综述78-85
• 参考文献82-85
• 发表论文85-86
• 致谢86

【参考文献】

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1 张静;郑兴;秦永文;周炳炎;吴弘;王洪如;;家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚一家系调查分析[J];中华心血管病杂志;2007年03期

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本文编号：270725