葫芦素E对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制作用及其机制研究

发布时间：2017-03-27 17:17

  本文关键词：葫芦素E对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 葫芦素E（cucurbitacin E，CuE）是从葫芦科属植物中分离得到的四环三萜类天然化合物，具有广泛的生物学活性,包括抗炎和抗肿瘤作用。近年的研究发现，葫芦素类化合物具有改变多种肿瘤细胞形态，破坏细胞骨架，使细胞周期发生阻滞的作用,从而发挥抗肿瘤作用。但其抗炎机制尚没有完全阐明。本研究以CuE为主，分析其对脂多糖（LPS）激活的小鼠巨噬细胞RAW264.7表达的肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等炎症反应的影响，以及对MAPKs信号通路、NF-κB信号通路蛋白活化和NF-κB的核转位的作用，在细胞和分子水平探讨其抗炎机制。 方法 1.小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞置于含体积10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37C、5%CO2的恒温培养箱中培养。 2.配置不同浓度的CuE（0.16mol/L、4mol/L、20mol/L、100mol/L）处理RAW264.7细胞48小时，用MTS方法检测CuE对细胞存活的影响，，用吸光度为490nm的酶标仪检测吸光率，从而计算细胞存活率和半数抑制率(IC50)，根据结果选择合适药物浓度。 3.不同浓度的CuE处理LPS活化的RAW264.7细胞12小时后，用相差显微镜观察细胞形态的变化，拍照记录。采用免疫印迹方法和蛋白定量方法检测G-actin和F-actin的表达量，通过细胞免疫荧光染色方法检测细胞内-actin的分布。 4.碘化丙锭（PI）染色法检测LPS活化的RAW264.7细胞与不同浓度的CuE共同孵育24小时后的细胞周期变化。 5.用细胞因子染色法结合流式细胞仪检测，分析CuE对LPS活化的RAW264.7表达细胞因子TNF-α和IL-1的影响。 6.用免疫印迹法检测MAPKs信号通路磷酸化蛋白(p-p38、p-JNK、p-ERK1/2)和NF-κB信号通路蛋白（p-IκB、p-p65、IκB、p65）的水平，以及NF-κB的核转位的情况。 结果： 1.不同浓度的CuE处理RAW264.7细胞48小时后，细胞增殖随着CuE浓度的增加而减少，当CuE浓度达到100mol/L时，细胞存活率只有16.540.70%。提示CuE对RAW264.7细胞具有生长抑制作用，计算得到CuE的IC50为7.79mol/L，为进一步实验药物浓度的选择提供了依据。 2．细胞形态观察表明，LPS刺激RAW264.7细胞与对照组相比，细胞体积变大，伪足伸长；加CuE后细胞变圆，伪足消失。 3.免疫印迹结果显示，G-actin的蛋白含量随着CuE的加入而减少，而在F-actin量则增多；免疫荧光显示actin蛋白在细胞内由弥散分布变为聚集分布。 4. PI染色显示，不同浓度的CuE作用LPS刺激活化的RAW264.7细胞24小时后，细胞周期大部分阻滞于G2/M期。 5.细胞因子染色显示，不同浓度的CuE作用LPS活化的RAW264.7细胞6小时后，细胞因子TNF-α、IL-1的表达量呈剂量依赖性抑制。 6.核质分离实验显示，不同浓度的CuE培养LPS活化的RAW264.7细胞4小时后，NF-B蛋白核转位的量减少，并呈剂量依赖性。 7.免疫印迹显示，不同浓度的CuE对LPS活化的RAW264.7细胞的MAPKs信号通路和NF-B信号通路蛋白并无太大的影响。结论： 1. CuE能够剂量依赖性的抑制RAW264.7细胞增殖，改变细胞形态，使actin聚集，并使其细胞周期阻抑于G2/M期，这些可能是CuE起到抗炎作用的机制之一。 2. CuE能够剂量依赖性抑制细胞因子TNF-α和IL-1的表达，以及NF-B蛋白的核转位，但对MAPKs信号通路和NF-B信号通路活化没有显著的影响，表明CuE可能是通过抑制LPS活化的RAW264.7细胞的NF-B核转位，导致细胞因子TNF-α和IL-1的表达量减少，从而表现出抗炎效应。
【关键词】：葫芦素E 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 脂多糖（LPS） 细胞骨架 NF-κB
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 一、前言10-18
• 1 葫芦素10
• 2 葫芦素 E10-14
• 2.1 葫芦素 E 的化学性质10-11
• 2.2 葫芦素 E 的抗肿瘤作用11-12
• 2.3 葫芦素 E 对细胞周期的作用12-13
• 2.4 葫芦素 E 对细胞骨架的影响13-14
• 3 MAPKs 信号通路14-15
• 4 NF-κB 信号通路15-16
• 5 本课题的研究目的和意义16-18
• 二、实验材料与设备18-22
• 1. 实验细胞株18
• 2. 主要试剂18-19
• 3. 主要仪器19
• 4. 主要溶液配方19-22
• 三、实验方法与步骤22-27
• 1. 细胞培养22
• 2. 细胞增殖测定22
• 3. 细胞形态学观察22-23
• 4. PI 染色检测 CuE 对 RAW264.7 巨噬细胞周期的影响23
• 5. 细胞免疫荧光观察 CuE 对 RAW 264.7 巨噬细胞的影响23-24
• 6. 细胞内细胞因子染色检测 CuE 对 RAW 264.7 巨噬细胞内 TNF-α的表达24
• 7. 核质分离蛋白抽提和免疫印迹分析24-26
• 8. 统计学分析26-27
• 四、实验结果27-36
• 1. CuE 对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞存活率的影响27
• 2. CuE 对 LPS 活化的小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 细胞形态的影响27-28
• 3. CuE 对 LPS 活化的小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 细胞骨架的影响28-30
• 4. CuE 对 LPS 活化的小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 细胞周期的影响30-32
• 5. CuE 对 LPS 活化的 RAW 264.7 细胞表达细胞因子 TNF-α和 IL-1 的影响32-33
• 6. CuE 对 LPS 活化的 RAW 264.7 细胞 MAPKs 信号通路和 NF-κB 信号通路的影响33-34
• 7. CuE 对 LPS 活化的 RAW264.7 细胞 NF-κB 蛋白核转位的影响34-36
• 五、讨论36-39
• 参考文献39-47
• 全文总结47-48
• 发表论文48-49
• 致谢49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：270757