斑马鱼M型丙酮酸激酶功能的初步研究

发布时间：2017-03-29 05:07

  本文关键词：斑马鱼M型丙酮酸激酶功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙酮酸激酶(PK)是糖酵解过程中的最后一个关键限速酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生一分子丙酮酸和一分子腺苷三磷酸(ATP)。在哺乳动物中,丙酮酸激酶分为PKLR和PKM两种形式,PKM又根据剪接方式的不同分为PKMl和PKM2,分别包含外显子9和外显子10。PKM1主要表达于高耗能组织如心脏、骨髂肌和脑组织,PKM2则主要表达于胚胎组织和快速增殖的肿瘤细胞中。近年来研究表明PKM2不仅作为丙酮酸激酶参与糖酵解过程,而且还具有蛋白激酶的活性。PKM2现已成为热门研究领域,科学家主要集中在研究PKM2在肿瘤细胞中的作用。研究发现,PKM2参与肿瘤细胞的Warburg效应,使肿瘤细胞在氧气存在的情况下也通过有氧糖酵解的方式进行代谢。PKM2主要以二聚体和四聚体两种形式发挥作用,在正常细胞中,PKM2主要以四聚体形式存在,具有丙酮酸激酶的活性,而二聚体形式的PKM2主要存在于肿瘤细胞中,具有蛋白激酶的活性。近年来的研究已经证实,PKM2在肿瘤的发生和发展中发挥重要功能,其作用机理已经被基本阐明,成为近年来肿瘤研究的热点。研究表明,缺氧能上调肿瘤细胞PKM2的表达水平,并且也已证实PKM2是HIF-1α直接调控的靶基因。经生物信息学分析,在PKM2的第一个内含子上有一个缺氧反应元件(HRE),可被缺氧诱导因子1(HIF-1α)识别,从而调节PKM2的转录激活。对PKM2的氨基酸序列进行分析发现,其羧基端具有核定位信号Arg399/400,在缺氧条件下会进到细胞核中发挥作用。在核内,PKM2和HIF-1α相互作用,激活HIF-1α的转录活性,从而促进HIF-1α靶基因的转录,包括和糖酵解相关的葡萄糖转运子以及乳酸脱氢酶A,PKM2作为HIF-1α的靶基因,其转录活性也会被调控,这样就在PKM2和HIF-1α之间形成一个反馈调节。然而,尽管PKM2与HIF-1α能够相互作用已经毋庸置疑,但是这些研究都是在体外细胞中进行的,至今尚无体内研究证明二者相互作用及体内生物学功能,尤其PKM2是否在早期胚胎发育中发挥作用,其是否参与了HIF在胚胎发育中的作用还是空白。现在的观点认为,肿瘤是发育生物学问题。PKM2既然对肿瘤至关重要,推测其在胚胎发育中极有可能发挥重要作用。而斑马鱼作为新型模式动物,在发育生物学的应用相当广泛。斑马鱼基因数据库分析显示,在斑马鱼存在两个pkm基因,命名为pkma和pkmb,分别位于斑马鱼18号、25号染色体。结构分析表明,其与哺乳动物高度保守。其中,斑马鱼中pkma基因又分为两个剪切本(Transcript),根据其cDNA碱基数分别命名为pkma-2404、pkma-2412,是同一基因pkma在转录过程中由前体mRNA经过不同的选择性剪切的产物。pkma-2412包含外显子10,pkma-2404不含外显子10但特异含有原内含子9的一部分。通过生物信息学分析,我们发现在pkma和pkmb上都存在核定位信号,并且在序列上游都存在HRE。通过RT-PCR我们发现pkma-2404和pkmb在胚胎发育时期和成鱼体内都有表达,而pkma-2412只在胚胎发育早期和成鱼体内有表达。然后我们又通过对斑马鱼胚胎和成鱼分别进行缺氧发现pkma和pkmb都受缺氧调控,将带有GFP标签的表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞,以p2.1作为报告质粒,然后检测双荧光素酶的活性发现,Pkma能使双荧光素酶的活性显著上升,说明Pkma能与HIF-1α相互作用。我们通过瞬时转染Hela细胞还发现,Pkma和Pkmb在缺氧条件下可以进入到细胞核。之后,我们通过斑马鱼胚胎过表达HIF-1α发现,过表达HIF-1α能上调pkma mRNA的表达水平,推测pkma是HIF-1α的靶基因。综上所述,斑马鱼pkm基因是受缺氧调控的,从体内实验证明了pkma可能是HIF-1α的靶基因,并且我们对pkm在胚胎发育早期的功能也有了一定的认识。
【关键词】：M型丙酮酸激酶 缺氧诱导因子-1α 缺氧 斑马鱼
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q55;R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 前言12-28
• 1.1 模式动物——斑马鱼12-13
• 1.2 丙酮酸激酶(PK)13-18
• 1.2.1 丙酮酸激酶简介13
• 1.2.2 PKM的可变剪接机制13
• 1.2.3 PKM2的活性13-14
• 1.2.4 PKM2在基因转录和肿瘤发生的功能14-16
• 1.2.5 核定位信号与PKM2的进核机制16-18
• 1.2.6 PKM2作为治疗肿瘤的新靶点18
• 1.3 斑马鱼pkm基因18
• 1.4 缺氧与缺氧诱导因子(HIFs)18-24
• 1.4.1 缺氧18-19
• 1.4.2 缺氧手段19
• 1.4.3 生物体对缺氧的应答机制19-20
• 1.4.4 HIF-1的结构20
• 1.4.5 HIF-1的活性20-21
• 1.4.6 缺氧反应元件(Hypoxia Response Elements,HRE)21
• 1.4.7 HIF一1的靶基因21
• 1.4.8 HIF-1与PKM2的关系21-23
• 1.4.9 HIF-1α与肿瘤的关系23-24
• 1.5 CRISPR/Cas9技术24-25
• 1.6 本论文的立题依据25-27
• 1.7 本论文的研究意义27-28
• 2 斑马鱼pkm在早期胚胎发育的研究28-55
• 2.1 实验材料与方法28-43
• 2.1.1 实验材料28
• 2.1.2 主要化学和生物试剂28
• 2.1.3 实验仪器28-29
• 2.1.4 实验方法29-43
• 2.2 实验结果43-51
• 2.2.1 斑马鱼pkma/pkmb的序列分析43-44
• 2.2.2 斑马鱼pkma/pkmb的时空表达谱分析44-45
• 2.2.3 缺氧对斑马鱼成鱼和胚胎pkm mRNA表达水平的影响45-46
• 2.2.4 斑马鱼Pkma与HIF-1α有相互作用46-49
• 2.2.5 pkma是HIF-1α的靶基因49-50
• 2.2.6 利用Cas9技术构建Pkmb敲除的突变体50-51
• 2.3 总结与讨论51-55
• 2.3.1 pkma/pkmb在斑马鱼胚胎发育早期有表达51-52
• 2.3.2 缺氧能上调pkma/pkmb的表达以及Pkma/Pkmb和HIF-1α相互作用52-53
• 2.3.3 缺氧能诱导Pkma/Pkmb入核53-54
• 2.3.4 运用Cas9基因敲除技术构建Pkma/Pkmb功能缺失的突变体54-55
• 3 展望55-57
• 3.1 确定pkma/pkmb在斑马鱼胚胎发育中的功能及机制55
• 3.2 探究Pkma/Pkmb是否和HIF-1α相互作用55-56
• 3.3 Pkma/Pkmb在胚胎发育中的作用是否与HIF信号通路相关56-57
• 参考文献57-62
• 致谢62-64
• 个人简历64
• 发表的学术论文64

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