基于RNA-seq技术对鼠疫耶尔森氏菌小RNA的筛选与鉴定

发布时间：2017-03-29 13:02

  本文关键词：基于RNA-seq技术对鼠疫耶尔森氏菌小RNA的筛选与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鼠疫是鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性传染病。鼠疫可通过蚤叮咬或者其它途传染给人,引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。调节小RNAs (small regulatory RNAs, sRNAs)是一类长度在50-500个核苷酸,位于基因间区或反义链上,不编码蛋白质的RNAs。sRNAs通过与靶mRNA配对,模拟其他核酸结构或调节蛋白活性在转录后水平发挥调控作用,其调控作用大多需要伴侣蛋白Hfq (host factor for RNA phage Qβ)的参与。近年来研究发现sRNAs在细菌代谢、毒力和宿主环境适应性等多个方面发挥着重要作用。RNA-seq (RNA sequencing)是基于高通量测序技术研究转录组的新方法,可以同时用于研究致病菌和宿主转录组,也可以预测基因的转录起始位点并发现新的sRNAs。 本研究提取体外(BHI和TMH培养基内26℃培养基至对数中期)和体内(滴鼻感染48hr小鼠肺脏和脾脏)条件下的鼠疫菌总RNA,变性胶分离并分别回收50-150nt和130-500nt RNA,磷酸化后分别加接头,逆转录制备cDNA文库进行高通量深度测序(RNA-seq),去接头、去污染和剔除rRNA和tRNA后,对获得的序列进行基因组定位,筛选获得位于基因间区和反义链的转录本。 挑选存在于两个样品以上的转录本,最终筛选获得104个鼠疫菌sRNAs。其中,78个是鼠疫菌中新发现的,26个是已经注释的。新发现的78个鼠疫菌sRNAs中,有62个位于基因间区,16个位于基因的反义链上。共有5个新的鼠疫菌小RNA位于pMT1和pPCPl质粒上。 我们采用引物延伸实验确定了鼠疫菌sRNAs sR034、sR035和sR084的转录起始位点,与RNA-seq结果一致,并采用Northern Blot方法验证了14个新sRNAs的存在,且大小与测序结果基本一致,验证了RNA-seq用来同时筛选不同样品中的sRNAs的准确性和可靠性。除此以外,我们还通过Northern blot实验验证了9个新的sRNAs稳定性依赖于RNA伴侣分子Hfq蛋白,并确定了CRP调控元的3个sRNAs新成员—sR065、sR066和sR084。
【关键词】：鼠疫菌 sRNAs RNA-seq Hfq
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.61
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 缩略语6-9
• 第一部分 文献综述及选题的目的和意义9-20
• 1. 鼠疫的流行与危害9-12
• 1.1 鼠疫菌的传播途径10
• 1.2 鼠疫菌的病原学特征10-12
• 2. 细菌基因表达调控12-14
• 2.1 细菌基因表达调控类型及特点12-13
• 2.2 细菌的转录调控子13-14
• 3. sRNAs的调控与功能研究进展14-16
• 3.1 sRNAs概述14
• 3.2 sRNAs的作用机制14-15
• 3.3 sRNAs调控细菌生理与毒力15-16
• 4. Hfq蛋白密切参与sRNAs调控16-17
• 5. sRNAs的大规模筛选与鉴定技术17-18
• 6. 选题的目的和意义18-20
• 第二部分 材料和方法20-42
• 1. 材料20-30
• 1.1 菌株20
• 1.2 培养基20-24
• 1.4 主要仪器和设备24-25
• 1.5 其他试剂及配制方法25-28
• 1.6 实验动物28-29
• 1.7 实验所用引物汇总29-30
• 2. 方法30-42
• 2.1 细菌的培养与体内感染BALB/c小鼠30
• 2.2 体内感染BALB/c小鼠30-31
• 2.3 Trizol提取总RNA和sRNAs片段富集31-33
• 2.4 cDNA文库的制备、测序与数据分析33-34
• 2.5 引物延伸实验确定sRNAs的转录起始位点34-36
• 2.6 Northern Blotting验证sRNAs的存在与大小36-42
• 第三部分 结果及讨论42-57
• 1. 结果42-53
• 1.1 基于RNA-seq技术筛选到104个sRNAs42-45
• 1.2 部分sRNAs转录起始位点的确定45-48
• 1.3 部分sRNAs存在与大小的验证48-49
• 1.4 sR034与sR035表达丰度验证49-50
• 1.5 部分sRNAs稳定性的Hfq依赖性验证50-51
• 1.6 CRP调控sRNAs的预测与验证51-53
• 2. 讨论53-57
• 2.1 RNA-seq用于致病菌和宿主转录组的研究53-54
• 2.2 sRNAs与鼠疫菌进化54
• 2.3 Hfq对鼠疫菌sRNAs的作用54-55
• 2.4 sRNAs与鼠疫菌生理和毒力55-57
• 第四部分 结论57-58
• 参考文献58-62
• 致谢62-64
• 攻读硕士期间主要成果64

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孟霞;孟宪臣;朱春红;王亨;王金秋;聂佳佳;朱国强;;肠炎沙门氏菌hfq缺失株的构建和对fliC基因的调控分析[J];中国预防兽医学报;2013年09期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李自慧;结核分枝杆菌非编码RNA的系统发现和鉴定[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 陈秀琴;Hfq对霍乱弧菌环境适应能力的影响及相关基因的转录调控[D];青岛大学;2013年

2 刘钟慧;耻垢分枝杆菌体外非编码RNA的鉴定与初步分析[D];华中农业大学;2013年

3 朱颖;RNA适体与代谢小分子相互作用的研究[D];中国海洋大学;2013年

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本文编号：274517