树突状细胞来源外排体对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

发布时间：2017-03-29 10:24

  本文关键词：树突状细胞来源外排体对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有很强的免疫调节作用，其主要的靶细胞为树突状细胞（dendritic cells，DC）。然而，对于DC对MSC的生物学特性的影响及其介质，目前未见系统报告。本实验以DC释放的外排体（DC-derived exosome，DCex）为观察对象，探讨了DC对MSC的可能作用。首先，分离培养人骨髓MSC，并从细胞形态、表型及分化功能予以鉴定。体外诱导培养人骨髓来源的DC，通过观察细胞形态、流式检测表型给予鉴定。应用超速离心法从DC条件培养上清中分离提取DCex，电镜观察DCex形态特点，通过流式检测明确其细胞来源，BCA蛋白定量法测定DCex蛋白浓度，从而建立一套可靠的制备及鉴定DCex实验体系。其次，以DAPI标记的MSC为研究对象，将DiI标记的DCex与MSC共培养，应用共聚焦显微镜观察MSC内吞DCex的可能性。最后，在无血清MSC培养体系中，分别加入不同蛋白质浓度DCex（0、1、2、5、10、15μg·ml-1），以0μg·ml-1组为对照，应用MTT法于24、48、72h后检测MSC增殖状态，并且利用CFSE标记及流式细胞学分析，进一步验证DCex对MSC的增殖作用。另取第3代MSC，设为3组培养诱导体系：①对照组：α-MEM基础培养基组；②实验组：α-MEM基础培养基+DCex（10ug·mL-1）组；③α-MEM基础培养基+标准诱导剂组。采用荧光实时定量PCR、琼脂糖凝胶电泳检测各组成骨分化转录因子Runx2在mRNA水平的表达情况,并进行碱性磷酸酶（ALP）活性检测。结果显示，分离培养的MSC，镜下为成纤维状贴壁细胞，可向成骨细胞和成脂细胞分化，表达CD44和CD73，不表达CD31、CD45和HLA-DR，符合国际干细胞协会关于间充质干细胞的鉴定标准。成功诱导培养出DC，可见DC表面典型的毛刺状突起，并表达CD80、CD86、CD83、HLA-DR。电镜观察发现，DCex呈圆形或椭圆形膜层结构，直径为40-100nm，符合外排体的基本形态特征。流式细胞学分析发现，DCex表达CD83、CD86、CD80和HLA-DR，证实了DCex的细胞来源。荧光标记的DCex与MSC共培养6h时，可在共聚焦显微镜下观察到MSC胞质内呈现荧光，随着作用时间延长，荧光强度逐渐增强。MTT实验显示，以0μg·mL-1DCex组作为对照（增殖率100%），实验组MSC增殖率分别为：（102.4±7.99）%、（114.6±5.82）%、（135.5±11.9）%、（198.3±17.6）%、（198.2±32.2）%、DCex浓度为1、2μg·mL-1的增殖效应不明显（P0.05）,而浓度为5、10、15μg·mL-1的实验组与对照组相比，差异显著（P0.05）。其中，当DCex浓度为10、15μg·mL-1时对MSCs的促增殖作用更明显（P0.001）。与对照组相比，DCex（5、10、15μg·mL-1）组细胞均在48h出现促增殖作用（P0.001）。CFSE标记及流式检测也证实DCex可促进间充质干细胞增殖。此外，按组培养第7天，DCex实验组Runx2表达较对照组增高，差异有统计学意义(P0.05)；MSC培养第14天，DCex组ALP含量OD值与对应蛋白比为2.22±0.27，显著高于阴性对照组（1.20±0.21）（P0.01），但低于标准诱导组（3.22±0.24）（P0.05）。 上述结果表明，，DCex可被MSC内吞由此引起MSC增殖速度加快，并使之向成骨细胞方向分化。因此推测，DCex可能是DC作用于MSC的一种新介质。
【关键词】：间充质干细胞 树突状细胞 外排体 增殖 成骨分化
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩写8-10
• 前言10
• 材料与方法10-23
• 结果23-27
• 附图27-34
• 附表34-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述 树突状来源外排体：一种免疫调节的新角色42-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

【参考文献】

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1 颜汝平;周海滨;李

本文编号：274266