SLC26A家族的电压依赖性

发布时间：2017-03-29 18:07

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【摘要】：哺乳动物的听觉具有高度的灵敏度和精确性,这是因为它内耳的耳蜗具有放大功能,而驱动耳蜗放大的基础就是外毛细胞的电致运动。哺乳动物的外毛细胞可以在电刺激下改变其自身的长度此即为电致运动。电致运动的分子马达是外毛细胞的膜组成蛋白prestin。当电压改变时,外毛细胞胞内的氯离子受电压驱动而进出prestin蛋白,导致prestin发生构象变化,最终使得外毛细胞出现伸缩运动。与电致运动相联系的电记号是电压依赖性的膜电容也称为非线性膜电容(Nonlinear capacitance, NLC)。根据核苷酸序列分析可以将prestin归为溶质转运体26A家族(SLC26A), prestin是其第五个成员。现已发现SLC26A家族有11个成员(A1-A11),它们分布在不同组织的上皮细胞上且均为膜蛋白。它们的结构非常相似包括：胞质内的N-端、C-端以及结构未知的跨膜区域。结构的相似性也预示着它们的功能可能非常相似。在哺乳动物中,SLC26A家族成员的功能分为两类,一类是转运阴离子的功能,一类是prestin (A5)所特有的运动功能。而在非哺乳类脊椎动物中prestin (A5)与其它成员类似只具有转运功能。因此,我们推测prestin(A5)的运动功能可能是进化而来的。另外,哺乳动物prestin (A5)运动功能的产生与其电压依赖性密切相关,它是先感受膜电位的变化再产生运动的,也就是说电压依赖性是其产生运动功能的基础。那么,prestin (A5)的电压依赖性是其特有的还是整个SLC26A家族所共有的呢?为了解决这一问题,我们需要研究SLC26A家族其它成员的电压依赖性。我们用已知的SLC26A家族成员的蛋白序列做了一个无根的系统进化树并从系统进化树的每个分支中选择一个成员(A2, A4, A6, A7, A9, A11)作为研究对象。本实验选取人胚肾293细胞(HEK-293)转染所选取的SLC26A家族基因的,使其表达后,用全细胞膜片钳技术记录其膜电容,以了解SLC26A家族的电压依赖性。实验的第一步是构建并提取目的质粒。我们首先将目的基因与绿色荧光蛋白载体连接,然后通过质粒转化和质粒提取步骤获得目的质粒。第二步是将目的质粒用Lipofectamine2000转染进HEK-293细胞中。转染成功的HEK-293细胞其细胞膜会发出绿色荧光。第三步是采用单细胞膜片钳全细胞记录技术,给予转染成功的HEK-293细胞两个正弦波电压刺激(峰值为10mV,频率为390.6和781.2赫兹),记录其膜电容,然后分析比较各成员的膜电容,以了解其电压依赖性。同时,我们通过改变细胞内外液的离子成分,来了解膜电容的变化与离子的关系。我们将A5(prestin)作为阳性对照而把只转染有绿色荧光蛋白的HEK-293细胞作为阴性对照。实验中在细胞内外液均含C1-的情况下记录到的细胞数如下：A2为13个,A4为8个,A5(prestin)为9个,A6为15个,A7为11个,A9为10个,A11为8个。在分别表达有A2,A4,A6,A7,A9或A11的HEK-293细胞上均记录到非线性膜电容(NLC),即本实验所选取的SLC26A家族成员都有电压依赖性。对NLC用Boltzmann方程拟合并将所得到的参数进行比较后发现：标准化的NLC (NLC/Clin)最大的是A5(prestin),为7.80±3.27(mean±SD)；最小的是A2,为1.65±0.70;与A5(prestin)最接近的是A6,为6.94±2.30。而标准化的最大电荷移动(Qmax/Clin),峰值电压(W1/2)以及z值(曲线斜率)与A5(prestin)比较接近的也是A6(A5:12.72±4.61fC/pF,-69.79±8.30mV和0.70±0.07; A6:12.02±3.28fC/pF,-41.74±17.12mV和0.55±0.08)。从以上结果可以得出A6与A5(prestin)的电压依赖性最为相似,这与系统进化树所显示的A5(prestin)与A6的亲缘关系最近是相一致的。由于A5(prestin)和A6在电压依赖性方面具有相似性,而A6与其它SLC26A家族成员在功能方面具有相似性,因此A6作为连接A5(prestin)与SLC26A家族的桥梁值得我们重点研究。对于prestin (A5)来说,胞内的C1-是其主要的电压感受性的离子,其NLC是由于胞内C1-在电压驱动下在蛋白内移动而产生的。如果将细胞内液中的C1-用戊烷磺酸钠替换掉其NLC会减少甚至消失。我们用同样的方法处理并记录表达有A6的HEK-293细胞,观察其NLC的变化,发现：用戊烷磺酸钠替换C1-后A6的NLC并没有出现显著的变化。而且从Boltzmann方程拟合得到的参数V1/2, z, Qmax/Clin和NLC/Clin来看,两者也都没有显著性差异(P值分别为0.718、0.143、0.138、0.534,t检验)。这说明可能是胞外的C1-进入了蛋白或其它的离子参与NLC的产生。为了验证以上推测,我们给予细胞1mmol的DIDS以阻断蛋白通道,发现在加入DIDS后,A6的NLC (n=4)有明显的下降(并没有完全消失),且与细胞内液中含C1-或不含C1-所记录到的NLC均有显著性差异(P0.05,t检验)。以上结果说明,A6的NLC主要是由胞外电压感受性的C1-在蛋白内移动而产生的,其它离子也可能少量参与。为了进一步验证我们的想法,我们以NLC最小的A2作为研究对象,探究C1-以外的离子对其NLC的贡献。我们在外液中加入S042-进行记录,发现在加入8042-后标准化的NLC (n=13)有明显的增大,是仅含C1-的2倍左右,两者有显著性差异(P0.01,t检验)。为了进一步明确这一现象我们又同时记录了A11,因为人类的A11特异性的转运SO42-。与A2类似,当细胞外液中含8042-时,A11标准化的NLC (n=11)也明显增大,约为仅含C1-的2倍,两者有显著性差异(P0.05,t检验)。加入8042-后NLC是原来的两倍,我们认为这可能是由于S042-本身带两个电荷所引起。由此我们可以得出C1-并不是SLC26A家族唯一的电压感受性的离子。综上所述,本实验得出以下结论：1.在SLC26A家族中,A5(prestin)和A6的亲缘关系最近。2.电压依赖性是SLC26A家族的共有特性且A5和A6最为相似。3. SLC26A家族电压依赖性的产生机制是电压敏感性的离子在蛋白内移动。4.C1-并不是SLC26A家族中唯一的电压感受性的离子。以上这些结论说明SLC26A转运体是一种电压门控性的转运体,其基因序列中可能有一段编码电压感受的保守序列且它可能对其电压感受性的离子没有选择性。
【关键词】：Prestin 溶质转运体26A家族 电压依赖性 非线性膜电容
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R338.3
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