ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究

发布时间：2017-04-01 07:00

  本文关键词：ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程,而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团,从而引起碱基配对错误。利用ENU可在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段,本实验室筛选获得了一种显性遗传的腹部白斑小鼠,该小鼠突变纯合子表现为严重花斑表型且出现巨结肠症。本研究以该突变系小鼠为研究对象,从以下3个部分开展研究工作： 1ENU诱变获得一种巨结肠症小鼠 通过ENU诱变C57BL/6(B6)雄性小鼠后将其与正常B6雌鼠合笼,在G1代小鼠中筛查发现了一例腹部白斑表型的小鼠。将其与野生型B6小鼠配种后记录的25只后代小鼠中,其中9例小鼠表现为腹部白斑表型。将该杂合子小鼠互交获得42只小鼠,其中12只为花斑表型的突变纯合子小鼠,进一步研究发现突变纯合子小鼠表现为腹部肿大,并于出生后数周死亡。解剖发现,突变纯合子小鼠出现严重的巨结肠表型。 2巨结肠突变基因的定位及鉴定 为了定位该突变基因,将(B6×D2)F1突变杂合子小鼠互交获得F2代巨结肠小鼠,提取F2代小鼠的鼠尾DNA,利用微卫星对突变小鼠的染色体进行基因组扫描。定位结果表明在24个样品中突变基因与微卫星D14mit165及D14mi265未发生一例交换；最终将突变基因定位于微卫星D14Mit165与D4Mit265之间(或附近),通过对局部区域基因功能分析,初步判定Ednrb基因为本突变候选基因。 设计扩增针对Ednrb基因编码区引物,对野生型及巨结肠小鼠脑总RNA进行RT-PCR扩增,产物回收后进行测序比对,结果显示B6小鼠编码区第865位碱基为T,而巨结肠小鼠为C,该突变位于Ednrb基因第4号外显子。氨基酸序列预测表明,该突变引起EDNRB蛋白第286位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所替代(L286P),突变发生在EDNRB蛋白第5跨膜区。 3Ednrb (L286P)错义突变对细胞内Ca2+浓度的影响 扩增野生型及突变纯合子小鼠Ednrb基因,将其克隆至(?)pCMV-tag2B真核表达载体,分别命名为pCMV-tag2B-WETB、pCMV-tag2B-METB。用脂质体2000将以上重组载体转染于CHO-K1细胞,同时设pCMV-tag2B空载体为对照组。转染24～48h左右加入Fluo4-AM孵育30min后采用三个不同浓度ET-3刺激15min,最终通过多功能酶标仪检测细胞内荧光强度。结果发现：与转染pCMV-tag2B-WETB组相比,转染pCMV-tag2B-METB组细胞内Ca2+浓度显著降低,进一步表明L286P突变可影响EDNRB蛋白功能,是引起巨结肠表型的主要原因。
【关键词】：ENU 巨结肠症 基因定位 Ednrb基因 Ca~(2+)浓度测定
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R574.62
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-8
• 符号说明8-9
• 第一部分 文献综述9-25
• 第一章 ENU诱变及突变基因的定位和克隆9-13
• 1 ENU诱变的基本原理9-10
• 2 诱变及筛查的手段10-11
• 3 突变基因的定位及克隆11
• 4 国内外ENU诱变研究进展11-13
• 第二章 先天性巨结肠症及其相关基因13-18
• 1 RET基因14-15
• 2 GDNF15
• 3 SOX1015-16
• 4 PHOX2B基因16
• 5 ZFHX1B基因16-17
• 6 内皮素信号通路17-18
• 参考文献(References)18-25
• 第二部分 实验内容25-53
• 第三章 ENU诱变获得一例巨结肠症小鼠25-33
• 1 材料25-26
• 2 实验方法26-28
• 3 结果28-29
• 4 讨论29-30
• 参考文献(References)30-33
• 第四章 巨结肠突变基因的定位及鉴定33-42
• 1 材料33-34
• 2 实验方法34-36
• 3 结果36-38
• 4 讨论38-40
• 参考文献(References)40-42
• 第五章 Ednrb(L286P)错义突变对细胞内Ca~(2+)浓度的影响42-53
• 1 材料42-44
• 2 方法44-48
• 3 结果48-51
• 4 讨论51-52
• 参考文献(References)52-53
• 致谢53-54
• 攻读学位期间发表的学术论文目录54-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：280153