幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌细胞因子

发布时间：2017-04-01 06:58

  本文关键词：幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌细胞因子，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:体外克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα),观察其能否诱导巨噬细胞分泌细胞因子,并初步探讨其调控机制。方法:从Genebank上查得Hp的Tipα全基因序列,设计并合成Tipα序列特异性引物。以Hp基因组为模板,PCR扩增获得Tipα全长基因,经双酶切后与p ET28a载体相连得到重组质粒p ET28a-Tipα。经PCR、双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌BL21得到重组菌BL21/p ET28a-Tipα,利用IPTG诱导Tipα蛋白表达,以Ni-NTA亲和层析法纯化获得Tipα蛋白并利用Western-blot鉴定。培养人单核细胞系THP-1,用佛波脂诱导其分化为巨噬细胞后,用0~200μg/ml Tipα刺激24h,100μg/ml Tipα刺激0~36h。ELISA检测TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌情况;实时定量PCR检测TNF-α,IL-1β和IL-6 m RNA表达。Western blot观察Tipα处理前后巨噬细胞中p65蛋白的核转位情况;以NF-κB通路特异性抑制剂PDTC预孵育细胞,Tipα刺激后检测TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌水平。结果:(1)以Hp 26695株基因组为模板扩增获得Tipα全长基因,构建得到大肠杆菌表达质粒p ET28a-Tipα,质粒经PCR、双酶切和测序鉴定为p ET28a-Tipa载体构建成功,编码的蛋白序列与NCBI上的序列相同;重组质粒在大肠杆菌BL21中诱导表达出分子量约25k Da的融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析纯化获得高纯度的目的蛋白;并用Western-blot检测为His标记的目的蛋白。(2)Tipα蛋白以时间和浓度依赖性方式刺激巨噬细胞产生前炎症因子。巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平在一定范围内与Tipα蛋白的刺激浓度呈正相关。在0~24h的作用时间内,随刺激时间的延长,诱生炎症因子的水平逐渐升高。TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平与ELISA结果一致;(3)Tipα刺激巨噬细胞2h即可检测到p65亚基转位至细胞核内,持续至4h。在此时间内,细胞浆中p65水平逐渐降低;(4)PDTC预处理巨噬细胞后可显著抑制Tipα诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌。结论:幽门螺杆菌Tipα蛋白可能经激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌炎症细胞因子。
【关键词】：幽门螺杆菌 肿瘤坏死因子α诱导蛋白 巨噬细胞 细胞因子
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 主要英文缩略语索引4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 实验材料11-13
• 实验方法及步骤13-26
• 结果26-33
• 讨论33-36
• 结论36-37
• 参考文献37-39
• 文献综述39-44
• 参考文献42-44
• 参与课题与发表文章44-45
• 致谢45-46
• 附录1 pET28a-Tipα测序图46-47

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本文编号：280149