白介素-1β、HIF-1α和VEGF在兔骨性关节炎模型的滑膜中的表达

发布时间：2017-03-31 16:12

  本文关键词：白介素-1β、HIF-1α和VEGF在兔骨性关节炎模型的滑膜中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨性关节炎是中老年人最常见的疾病之一,由于人群预期寿命的延长,骨性关节炎的发病率也明显增高,尤其是肥胖的老年人群,60岁以上人群中,50%以上在X线上有骨性关节炎表现。其常见病理改变为软骨下骨硬化、关节周围骨赘形成、慢性滑膜炎,其引起的疼痛、功能障碍严重影响患者的生活质量。健康的软骨组织是一种无血管、神经、淋巴管的结缔组织,关节软骨的营养及供氧主要通过关节滑液及软骨下骨中取得。而整个关节是处于一种生理性低氧环境之中。既往研究显示关节滑液中的氧分压仅为6.65-7.98Kpa,表层软骨含氧量为7%-10%,随着深度增大这种缺氧不断增加,深层软骨含氧量仅为1%。正常情况下,这种低氧环境对关节软骨的正常生理功能具有重要意义。骨性关节炎病变时,某些细胞因子及蛋白如TNF-a, IL-1, IL-17促进滑膜成纤维细胞的增生,导致滑膜增殖,当滑膜组织的增殖速度超过想对应的血管增生的速度,以及关节腔内压力升高进一步减少关节腔内的供血,导致滑膜关节内缺氧会进一步加重,yudoh k及他的同事研究发现,这时的软骨表面的氧含量为3%-8%,在缺氧加重的条件下,许多种细胞内PHD-2、PHD-3显著增加,从而促进低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF-1)基因表达增加。 HIF-1是一种在缺氧状态下发挥作用的核转录因子(NF),是在进行低氧诱导的红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因表达的研究时发现的一种DNA结合蛋白。它是由HIF-1β和HIF-1β构成的异源二聚体,HIF-1α是bHLH-PAS蛋白家族中的一员,由于其结构中较HIF-1β多了一个氧依赖降解区域(oxygen-dependent degradation domain,ODD),因此HIF-1β是HIF-1调节缺氧中特有亚基。关节缺氧情况加重时,细胞浆内堆积的HIF-1α转移至核内,并与血管内皮生长因子(VEGF)DNA结合导致VEGF表达增高,VEGF是目前公认的一种促血管生成的因子,它导致内皮细胞增殖及迁移,或者通过环氧化酶-2(cox-2)等直接导致血管增生。在血管内皮生长因子发挥作用的同时,p-神经生长因子、神经肽同时发挥它们促神经生长的作用,这些新生的神经是沿着血管而生长,最终与新生血管一起,插入未骨化的软骨、半月板以及新生的骨赘之中。新生的血管虽然在某种程度上改善了关节中的供氧,但却同时促进了滑膜炎症的浸润,而新生的神经可能加重骨性关节炎的疼痛症状。 既往对于骨性关节炎的研究,主要是针对软骨及软骨下骨。近年来,人们发现慢性滑膜炎在骨性关节炎的发病机制中具有重要作用。在取行关节镜手术及关节置换的骨性关节炎患者的滑膜组织进行病理检查发现,骨性关节炎患者从发病早期到必须行关节置换手术的疾病晚期都伴随有慢性滑膜炎改变。滑膜炎发生时,滑膜细胞分泌多种促炎因子和细胞因子,介导下游因子参与软骨的破坏作用,IL-1p是这一过程中最重要的炎症因子之一,在骨性关节炎的发病过程中具有重要作用,它主要由CD14+滑膜巨噬细胞产生,能够促进软骨细胞及滑膜细胞分泌PGE2(前列腺素E2)及其他炎症介质,进一步促进滑膜炎症,诱导骨吸收。IL-1p加入体外培养的软骨细胞中,可激活诱导型NO合成酶(iNOS)产生大量的NO,NO作为IL-1p的下游产物,是IL-1p作用于软骨的主要效应分子,IL-1p从Fas途径对软骨细胞凋亡产生明显影响。IL-1p与TNF-a能与各自的细胞表面受体结合,激活炎症信号通路,最终激活核因子κB (NF-κB), NF-κB是一种转录因子,可以由压力有关的刺激,包括过度的机械应力和ECM的降解产物。一旦被激活,NF-κB的调节许多细胞因子,趋化因子,粘附分子,炎症介质,和几个基质降解酶MMPs的表达。MMPs是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族,广泛存在于结缔组织中,对软骨细胞外基质成分中的Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖具有高度的裂解活性,既往研究显示,IL-1β能促进MMP-13、3mRNA在软骨细胞中的表达,抑制Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖的合成,IL-1β还能促进MMP-1、3的合成代谢,通过降解Ⅱ型胶原蛋白,达到破坏关节软骨的目的。IL-1β还能够上调HIF-1α蛋白水平,上调下游基因VEGF的表达,促进滑膜组织中血管增殖,进而促进炎症浸润。 本研究利用木瓜蛋白酶行兔膝关节腔注射进行骨性关节炎模型制造,完成造模后切取膝关节中滑膜组织,采用ELISA方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的IL-1β、VEGF表达和采用Western blot方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的HIF-1α的表达,以探讨IL-1β、HIF-1α、VEGF的表达与OA之间的关系。 HIF-1α在兔膝关节骨性关节炎模型滑膜组织中表达研究 目的 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝关节腔注射制造兔膝关节骨性关节炎模型。 2、观察造模后不同时期兔膝关节滑膜及软骨的表现,并切取滑膜组织保存。 3、采用Western blot方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的HIF-1α的表达并探讨其意义。 材料和方法 按照实验设计,将30只雄性新西兰大白兔分为6组(实验组A1、A2、A3；对照组B1、B2、B3),每组5只,共10个膝关节。对实验组A1、A2、A3分别于第1、4、7天以1.6%木瓜蛋白酶行膝关节腔内注射制造兔膝关节骨性关节炎模型,予对照组B1、B2、B3分别于第1、4、7天以生理盐水行膝关节腔内注射作为对照。并分别在注射完成后2周、4周、6周后使用气体栓塞法分别处死A1B1.、 A2B2、A3B3组动物,切开动物膝关节,观察造模后2、4、6周后膝关节腔内滑膜增生及软骨退变情况,切取膝关节滑膜组织,迅速置于液氮瓶中,并最终置于-80℃的冰箱内保存,待6周后,滑膜标本采集完毕,将滑膜组织自冰箱内取出,加入组织裂解液后迅速研磨成匀浆液,采用Western blot方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的HIF-1α的表达。 结果 对照组B1、B2、B3组兔膝关节无肿胀、充血,关节液透明,滑膜组织无水肿、无肥厚,关节软骨半透明光滑,呈淡蓝色；A1、A2、A3组兔膝关节肿胀、充血明显关节液呈淡黄色浑浊状态,A1组滑膜组织稍增厚,关节面粗糙,关节软骨色泽灰暗,呈现骨性关节炎早期表现；A2组滑膜明显增厚关节面软骨色泽灰暗、溃疡形成,呈现骨性关节炎中期表现；A3组滑膜最厚,滑膜组织与股骨粘连严重,软骨缺损明显,部分软骨剥脱软骨下骨质暴露,呈现骨性关节炎晚期表现。模型组A1、A2、A3组滑膜中HIF-1α的表达分别与对照组B1、B2、B3组比较,A1组B1组、A2组B2组、A3组B3组(均P0.01)；模型组A1、A2、A3组滑膜中HIF-1α的表达差异有显著性,A1组A2组、A2组A3组(均P0.05)。 结论 造模后不同时期,兔膝关节表现出骨性关节炎早期、中期、晚期的表现,膝关节滑膜逐渐增厚,HIF-1α因子表达与膝关节滑膜增殖程度呈正相关,HIF-1α的差异表达与骨性关节炎退变有关。 IL-1β、VEGF在兔膝关节骨性关节炎模型滑膜组织中表达研究 目的 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝关节腔注射制造兔膝关节骨性关节炎模型。(与检 测HIF-1α蛋白来自相同的动物模型中) 2、采用ELISA方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的IL-1β、VEGF表达并探讨其意义。 材料和方法 造模方式与检测HIF-1α蛋白时相同,切取膝关节滑膜组织,加入缓冲液后研磨成匀浆分装后迅速置于-80℃冰箱保存备用,待标本完全备齐,将冷冻的滑膜组织取出,采用ELISA方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的IL-1β、VEGF表达。 结果 模型组A1、A2、A3组滑膜中IL-1β、VEGF的表达分别与对照组B1、B2、B3组比较,A1组B1组、A2组B2组、A3组B3组(均P0.01)；模型组A1、A2、A3组滑膜中IL-1β、VEGF的表达差异有显著性,A1组A2组、A2组A3组(均P0.05)。 结论 随着骨性关节炎病程进展,IL-1β、VEGF因子表达逐渐增高,IL-1β、VEGF的差异表达与骨性关节炎退变有关。
【关键词】：骨性关节炎 滑膜炎 低氧诱导因子(HIF-1α) 木瓜蛋白酶 骨性关节炎 滑膜炎 低氧诱导因子(HIF-1α) 血管内皮生长因子(VEGF)白介素-1β(IL-1β)
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R684.3
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-22
• 实验材料22-24
• 一、蛋白提取及试样所需试剂22
• 二、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂22
• 三、Western blot所需试剂22-23
• 四、ELISA所需材料23
• 五、造模所需试剂23-24
• 实验方法24-31
• 1 实验动物24-25
• 2 ELISA步骤25-26
• 3 Western blot方法检测实验性骨性关节炎滑膜中的HIF-1α的表达26-31
• 结果31-37
• 2.1 大体观察31-34
• 2.2 ELISA法检测滑膜的IL-lp和VEGF的表达34-35
• 2.3 Westenr blot测定滑膜中HIF-la的含量35-36
• 附图36-37
• 讨论37-45
• 1 兔膝关节模型建立37
• 2 IL-1β在骨性关节炎病程中的作用37-45
• 结论45-46
• 全文小结46-47
• 参考文献47-53
• 综述53-62
• 参考文献57-62
• 缩略词对照表62-63
• 攻读学位期间成果63-64
• 致谢64-65

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