人胎盘泌乳素的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

发布时间：2017-04-02 03:07

  本文关键词：人胎盘泌乳素的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人胎盘泌乳素（human placenta lactogen，hPL）又叫人绒毛膜生长催乳激素（chorionic somatomammotropin hormone，CSH），是由胎盘合体滋养层细胞合成并分泌入血的一种妊娠特异性激素。hPL基因位于第17号染色体上，其成熟肽具有191个氨基酸，分子量约为23000Da，是一种单链多肽类激素，分子内有两个二硫键。孕早期（5~6周）即可从母体外周血中检出，孕34~38周达到峰值，此后一直维持峰值至分娩。hPL具有促进乳腺发育、促进胎儿宫内生长发育、增加巨噬细胞表面受体表达等重要功能。当胎盘发生病理改变时，hPL的表达量相对降低。因此，测定母血中hPL的浓度，可以反映合体滋养细胞的状态，进而判断胎盘功能。妊娠晚期母血hPL水平还可以间接反映胎盘体积、重量和胎儿体重。动态监测不同妊娠时期hPL水平是监护高危妊娠、预测妊娠结局、了解胎儿宫内生长发育状况和指导临床诊断的一项可信参考指标。近几年来，孕期hPL检测已经逐渐受到临床医生的重视，这就需要大量的hPL蛋白标准品及抗hPL抗体，天然hPL蛋白来源有限且难于提纯，原核表达hPL蛋白可以有效改善其不足。本文主要研究内容和结果如下： 1. hPL基因的克隆及原核表达载体pQE30-hPL的构建 根据GeneBank提供的hPL基因序列（NM_001317.3），利用primer5.0软件针对成熟肽基因序列设计引物，上下游引物分别引入BamHI和HindⅢ限制性内切酶酶切位点。从人胎盘组织中提取总RNA，经RT-PCR技术扩增出hPL基因成熟肽编码区。 2. hPL的表达、纯化及复性 构建大肠杆菌表达系统M15(pREP4)/pQE-30-hPL，并以IPTG诱导表达出相对分子质量（M r）约为23000Da的包涵体蛋白，表达量占菌体总蛋白的67%。 包涵体蛋白经8M尿素变性后，应用Sephacryl S-200凝胶过滤层析纯化，经鉴定纯化后蛋白纯度大于90%，回收率达到60%。 应用Cu2+氧化稀释复性法、尿素浓度梯度透析复性法和色谱柱复性法，促进变性包涵体蛋白链内二硫键的形成，红系集落形成实验结果表明，原核表达的hPL蛋白复性后具有良好生物学活性。 Western blot法鉴定分析，纯化后hPL蛋白能与商品化的山羊抗hPL抗体特异性结合，显示出较好的抗原性及特异性。 3. hPL多克隆抗体制备 高纯度hPL蛋白免疫家兔，，得到兔抗血清。间接ELISA法测定其效价大于1:51200，阳性对照的包被抗原选择了商品化ELISA试剂盒中的hPL标准品，兔抗血清能与其抗原决定簇结合，证实抗体具有较好的反应性。以纯度高的抗原免疫机体获得了高效价的抗体，表明原核表达的hPL蛋白具有较好的免疫原性。 本研究，筛选得到了M15(pREP4)/pQE-30-hPL菌株，能够稳定携带重组质粒pQE-30-hPL。携带重组质粒的大肠杆菌经诱导后能高效表达hPL蛋白。建立了hPL包涵体蛋白纯化工艺。包涵体蛋白经过复性处理后具有良好生物学功能。原核表达的hPL蛋白抗原性及免疫原性良好，经纯化及进一步优化后有望作为抗原标准品。制备得到了高滴度有较好特异性的兔抗hPL多克隆抗体。综上，本文为hPL及其抗体的进一步临床应用研究奠定了基础。
【关键词】：人胎盘泌乳素 原核表达 纯化 复性 多克隆抗体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 引言12-18
• 1. hPL 的结构12-15
• 1.1 hPL 基因12-14
• 1.2 hPL 分子14-15
• 2. hPL 的生理作用15-16
• 2.1 生长促进作用15
• 2.2 催乳作用15
• 2.3 外周血管收缩作用15-16
• 2.4 对瘦素分泌的影响16
• 2.5 对单核细胞 CD163、CD14 表达的影响16
• 3. hPL 的临床意义16-17
• 4. 本研究的主要内容17-18
• 第2章 材料方法18-37
• 1. 主要材料试剂及实验设备18-24
• 1.1 菌株和质粒18
• 1.2 主要试剂18-19
• 1.3 各种试剂的配制19-23
• 1.4 实验动物23
• 1.5 主要仪器设备23-24
• 2. 实验方法24-37
• 2.1 hPL 基因的克隆及原核表达载体 pQE30-hPL 的构建24-30
• 2.2 hPL 的表达、纯化、复性及其活性鉴定30-35
• 2.3 hPL 多克隆抗体的制备35-37
• 第3章 实验结果37-49
• 1. hPL 基因的克隆37
• 2. TA 克隆37-39
• 2.1 pMD18-T 克隆载体37-38
• 2.2 重组克隆载体 pMD18-T-hPL 鉴定38-39
• 3. 原核表达载体 PQE-30-hPL 的构建39-43
• 3.1 pQE-30 质粒39-40
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定40-41
• 3.3 重组质粒的测序鉴定41
• 3.4 hPL-A 基因 CDS 序列41-42
• 3.5 hPL 的氨基酸序列及分子内二硫键42-43
• 4. hPL 的表达43-44
• 4.1 表达产物的鉴定43-44
• 4.2 诱导剂浓度及诱导时间的确定44
• 5. 包涵体 hPL 蛋白的纯化鉴定44-46
• 6. 原核表达 hPL 蛋白的特异性鉴定46-47
• 6.1 Western blot 分析46
• 6.2 ELISA 分析46-47
• 7. 原核表达 hPL 蛋白的复性鉴定47
• 8. hPL 多克隆抗体的检测47-49
• 第4章 讨论49-53
• 第5章 结论53-54
• 参考文献54-61
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

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本文编号：281751