淡色库蚊miR-279-3p和miR-4448与抗药性关系研究

发布时间：2017-04-03 15:05

  本文关键词：淡色库蚊miR-279-3p和miR-4448与抗药性关系研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蚊传播包括疟疾、登革热、西尼罗热等在内的多种蚊媒病。化学防治一直是蚊媒综合治理策略中的主要方法。然而随着化学杀虫剂的长期大量使用,蚊对多种杀虫剂均产生了不同程度的抗药性。蚊抗药性是由多基因共同决定的,其中细胞色素P450单加氧酶、酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶等基因表达量的改变与代谢抗性密切相关,然而这些解毒代谢酶基因的调控机制却鲜有报道。本课题组前期通过solexa测序的方法比较了淡色库蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系的microRNA表达谱。本课题选取了在溴氰菊酯敏感和抗性品系中具有显著表达差异的miR-279-3p和miR-4448,对其调控抗药性的机制进行进一步研究。 本研究首先克隆并测定淡色库蚊miR-279-3p和miR-4448前体pre-miR-279-3p和pre-miR-4448的序列；并采用实时荧光定量PCR验证两者在溴氰菊酯敏感和抗性品系中的表达差异。随后,预测两者的靶基因分别为CYP325BB1和CYP4H31,并检测其在敏感和抗性品系中的表达水平；运用双荧光报告系统验证miR-279-3p和miR-4448与其靶基因的直接作用。接着在细胞水平验证CYP325BB1和CYP4H31基因高表达对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响；并在蚊体内,运用口饲和基因注射的方法验证高表达miR-279-3p和miR-4448,对靶基因CYP325BB1和CYP4H31表达水平的调节,及对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响。 研究结果显示miR-279-3p和miR-4448均在敏感品系中高表达,分别为抗性品系的3.3倍(P0.01)和5.5倍(P0.001)；其靶基因CYP325BB1和CYP4H31则在抗性品系高表达,分别为敏感品系的2.3倍(P0.01)和4.97倍(P0.05)；双荧光报告实验证实miR-279-3p和miR-4448能直接靶向作用于CYP325BB1和CYP4H31的3'UTR。功能实验结果显示,高表达CYP325BB1和CYP4H31后,蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性降低；蚊体内高表达miR-279-3p和miR-4448后,其靶基因表达水平降低,且蚊对溴氰菊酯敏感性增加。以上结果表明,miR-279-3p和miR-4448通过调控CYP325BB1和CYP4H31的转录后水平影响蚊对溴氰菊酯的敏感性。 本课题首次报道了miR-279-3p和miR-4448通过调控其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的转录后水平来参与蚊抗药性的形成,对深入研究蚊抗药性机制具有重要的理论意义,为建立更有针对性的蚊抗药性防治技术提供新的依据。
【关键词】：miR-279-3p miR-4448 抗药性 细胞色素P450 淡色库蚊 溴氰菊酯
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R384.1
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-46
• 1 实验材料14-16
• 1.1 供试蚊14
• 1.2 细胞系14
• 1.3 主要试剂14-15
• 1.4 主要仪器设备15-16
• 2 实验方法16-46
• 2.1 淡色库蚊RNA和DNA提取与鉴定16-18
• 2.2 miR-279-3p和miR-4448前体pre-miRNA的测定18-22
• 2.3 验证miR-279-3p和miR-4448及CYP325BB1和CYP4H31表达水平22-27
• 2.4 验证miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的直接作用27-34
• 2.5 高表达CYP325BB1和CYP4H31对蚊溴氰菊酯敏感性的影响34-42
• 2.6 高表达miR-279-3p和miR-4448对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响42-46
• 结果46-71
• 1 淡色库蚊RNA提取与鉴定46-47
• 1.1 淡色库蚊RNA电泳鉴定46
• 1.2 淡色库蚊RNA浓度与纯度测定46-47
• 2 miR-279-3p和miR-4448前体pre-miRNA的鉴定47-49
• 2.1 PCR扩增pre-miR-279-3p和pre-miR-4448序列47-48
• 2.2 TA克隆测定pre-miR-279-3p和pre-miR-4448序列48-49
• 3 实时荧光定量PCR验证miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31表达水平49-51
• 3.1 预测miR-279-3p和miR-4448的靶基因49-50
• 3.2 实时荧光定量PCR鉴定miR-279-3p和miR-4448在淡色库蚊敏感和抗性品系中的表达水平50
• 3.3 实时荧光定量PCR鉴定CYP325BB1和CYP4H31在淡色库蚊敏感和抗性品系中的表达水平50-51
• 4 双荧光报告系统验证miR-279-3p和mi-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的直接作用51-58
• 4.1 CYP325BB1和CYP4H31部分3'UTR序列扩增51-54
• 4.2 双荧光报告载体构建54-57
• 4.3 双荧光报告检测结果57-58
• 5 细胞水平检测高表达CYP325BB1和CYP4H31对蚊溴氰菊酯敏感性的影响58-65
• 5.1 PCR扩增CYP325BB1和CYP4H31 ORF序列及其真核表达载体构建58-63
• 5.2 蚊细胞转染PIB-CYP325BB1和PIB-CYP4H31的效率验证63-64
• 5.3 高表达CYP325BB1和CYP4H31对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响64-65
• 6 口饲和基因注射microRNA mimic分析高表达miR-279-3p和miR-4448对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响65-71
• 6.1 实时荧光定量PCR验证口饲淡色库蚊microRNA mimic后miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31表达水平的变化65-66
• 6.2 口饲microRNA mimic分析高表达miR-279-3p和miR-4448对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响66-68
• 6.3 实时荧光定量PCR验证基因注射淡色库蚊microRNA mimic后靶基因CYP325BB1和CYP4H31表达水平的变化68-69
• 6.4 基因注射microRNA mimic高表达miR-279-3p和miR-4448对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响69-71
• 讨论71-75
• 小结75-76
• 参考文献76-82
• 综述82-94
• 参考文献89-94
• 攻读学位期间发表文章情况94-95
• 致谢95

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 郭韬;李广林;魏强;梁永宏;;植物MicroRNA功能的研究进展[J];西北植物学报;2011年11期

2 孟军;谭毅;;西尼罗病毒病流行状况及应对策略[J];应用预防医学;2013年02期

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本文编号：284510