补体攻膜复合物内皮细胞刺激效应及其活化机制的研究

发布时间：2020-11-09 08:41

　　 已有的研究资料向人们清楚地显示，亚溶破MAC可活化多种细胞生物 学效应，是体内补体过度活化病理效应的重要介导者之一。虽然已经发现 MAC沉积后可活化细胞内多种胞内信号分子，但MAC插入膜上后通过何种 机制介导胞内信号途径的活化目前仍不清楚。已知MAC插入质膜不需任何 受体，除了与已知的两种终末补体调控蛋白C8bp和CD59结合外，目前尚 未证实沉积于细胞表面MAC与其它的分子有直接的相互作用。那么，MAC 的跨膜信号转导机制究竟是什么？作为一个高度亲脂性蛋白，插入膜上的 MAC引起细胞信号传导入脑究竟有什么特殊之处？ 近年研究发现，哺乳动物细胞质膜表面存在主要由糖鞘脂（GSL）、鞘磷 脂（SM）及胆固醇聚集形成的膜微区结构，GPI锚固蛋白及其他一些膜分子， 特别是一些重要的信号转导分子如Src家族PTK、异三聚体G蛋白等，相 对特异性聚集于其中。Caveolae是多种细胞表面的膜微区形式，因具有特 征性的烧瓶样质膜内陷和特征性的结构蛋白caveolin而可与其它的膜微 区相区别。大量的研究显示，质膜上的这些膜局限性结构域中聚集着许多 重要跨膜信号转导分子，在细胞跨膜信号转导中发挥重要作用。此外，越 来越多的细胞生物学行为包括内吞、物质的跨膜转运、膜蛋白的定向分选 等均被发现与膜微区的功能相联系。对生理状态下膜微区结构和功能的认 识是一个目前研究非常活跃的领域。 、在思索MAC的跨膜信号转导的可能机制中，我们发现了以下有意义的 线索：第一，已经证实的多种参与MAC活化细胞的信号途径几乎无一例外 地被证实与质膜微区相联系，提示MAC可能与caveolae有功能上的联系。 第二，MAC在膜上的天然受体C8bP和CD59均为GPI－锚固型蛋白，近年的 研究证实W－锚固蛋白成簇分布于膜微区之中。而这些调控蛋白在细胞表 面高表达，可迅速地与沉积在膜上的MAC相结合。那么，特异性地定位于 特殊的膜微区之中的 CD59儿8bP对 MAC的分布有何影响？是否可介导 MAC 定位于膜微区之中？第三，MAC作为高度亲脂性的复合物，沉积于膜上后 可与脂质分子结合，形成胶束区并引起膜脂质重排。那么，MAC是否可与 质膜上大量散在分布的膜微区相互作用？ 基于以上的分析，我们大胆设想，MAC沉积至细胞膜上后，可通过与 脂质的相互作用而与膜微区产生物理上和功能上的联系。为探明沉积于细 胞表面的MAC与膜微区的关系，我们以人血管内皮细胞为模型，建立MAC 亚溶破体系并检测其刺激效应：纯化内皮细胞表面的caveolae结构，检测 MAC与caved 富集的膜区段之间的关系以及特异性破坏caveolae对MAC 介导的内皮细胞活化效应的影响。我们期望通过这一研究，更多地了解MAC 与膜上脂质分子的相互作用情况，并从一个新的角度认识eC可能的跨膜 信号转导机制。本文的主要研究内容及结果包括： 1．以纯化的补体终末成分体外组装MAC，并以之建立内皮细胞亚溶 破模型。其中CS的活化通过蛋氨酸氧化的方法在不裂解CS的条件下获得。 这种体外组装策略保证了体系中的刺激因素是真正功能纯的MAC，为进一 步深入研究MAC的病理效应及其信号转导机制奠定了良好的基础。 2．在MAC的内皮细胞亚溶破模型中，多角度地检测了亚溶破剂量的 MAC对内皮细胞的两种不同途径的分泌－－－－P小体分泌反应和需基因转 录的新蛋白合成分泌途径的活化效应，并以激光共聚焦显微镜动态观察 MAC沉积引起胞浆＊a‘”j i的变化。结果发现，eC可刺激内皮细胞 W干 ’J’ 体分泌反应，引起 VWF因子快速释放出胞：亚溶破剂量 MAC可诱导 IL士 趋化因子的蛋白合成及分泌；激光共聚焦显微镜下观测到MAC沉积后引起 ·Vlll· 的胞浆＊a’”j i增高和钙振荡，并发现不同的细胞在 MAC沉积后＊a‘”j i变 化模式存在异质性。 3．低温条件下以非离子型去污剂Trtion《 100纯化内皮细胞表面的 caveolae结构，检测沉积于细胞表面的MAC在蔗糖密度梯度离心场中的位 置。结果显示，沉积于膜上的MAC特征性地浓聚于低密度去污剂不溶性膜 区段中，该区段同时有caveolin的富集，提示MAC与caveolae存在直接 的物理联系。以甘露糖胺抑制内皮细胞GPI－锚固蛋白的表达，补体终末成 分的分布无明显改变，说明MAC的caveolae分布特性不依赖GPI－锚固蛋 白CD59。这是首次报道沉积于质膜表面的MAC与caveolae存在直接的物 理联系。 4．在证实MAC与cave01ae徽区结构有直接的物理联系的基础上，以 胆固醇结合剂Fn 和Nystatin特异性地破坏细胞表面册veolae结构 和功能，观测其对MAC介导的内皮细胞刺激效应的可能影响。结果显示， 特异性地破坏caveolae的结构与功能使MAC刺激内皮细胞分泌几E的效 应明显减低，但对VWF的分泌没有影响，提示MAC对胞内信号活化依赖 caveolae微区结构。此外，特异性抑伟聚集于caveolae 中的Src家族PTK 活性后，MAC刺激内皮细胞分泌几干的效应也显著地受到抑制。这一结果 提示，eC沉积于细胞表面后，可活化聚集于caveolae中的非
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R392.11
【文章目录】：
英文缩写词表
英文摘要
中文摘要
论文正文 补体攻膜复合物内皮细胞刺激效应及其活化机制的研究
    前言
    第一章 内皮细胞MAC亚溶破细胞模型的建立及其多种细胞刺激效应的检测
        第一节 氯胺-T氧化法活化C5、组装补体膜攻击复合物及其鉴定
        第二节 补体攻膜复合物内皮细胞亚溶破模型的建立及其细胞刺激效应
        第三节 MAC刺激体外培养人脐静脉内皮细胞胞内游离钙离子浓度变化
        第四节 人脐静脉内皮细胞对沉积的MAC的清除作用研究
    第二章 补体攻膜复合物与细胞表面膜微区的相互作用研究
        第一节 内皮细胞Caveolae结构的纯化制备
        第二节 沉积于质膜表面的MAC与Caveolae的关系
        第三节 Caveolae参与介导MAC细胞刺激效应
        第四节 内皮细胞通过Caveolae介导细胞表面MAC的清除
总结
致谢
照片
参考文献
文献综述 Caveolin家族分子研究进展
    参考文献
攻读博士学位期间发表的文章

【参考文献】

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1 安静,黎鳌,杨宗城;胎儿脐静脉内皮细胞的培养[J];第三军医大学学报;1990年03期

本文编号：2876169