人类Numb配体蛋白基因LNX的克隆和功能研究

发布时间：2020-11-09 17:47

　　 不对称细胞分裂是指1个细胞分裂为2个具有不同发育潜能的细胞，是产生细胞多样性的基本途径。Numb蛋白是神经发育中第一个被发现呈不对称分布的蛋白，是产生不对称细胞分裂的重要因素之一。我们从人胎脑cDNA文库中得到一条与小鼠Numb配体蛋白基因Lnx（Ligand of Numb Protein-X）高度同源的新基因。根据HUGO命名委员会同意，我们将其命名为人类Numb配体蛋白基因LNX。 该基因全长3737 bp，开放阅读框从236位到2134位，其编码蛋白含有4个PDZ结构域和1个与Numb蛋白的PTB结构域作用的LDNPAY基序。Northern杂交、RT-PCR和原位杂交显示，LNX mRNA在脑中的分布有一定的特异性，而且在胶质瘤组织中高表达。小鼠不同发育阶段的肾脏原位杂交显示，LNX mRNA 主要表达在肾脏髓质中，且随着肾脏的发育表达量逐渐减少。对基因芯片表达谱数据进行聚类分析，发现LNX基因的相关基因中包括FE65、Frizzled等信号传导相关基因。采用酵母双杂交系统，我们用LNX蛋白中的PDZ结构域为诱饵，筛选相互作用蛋白。我们发现Ski相互作用蛋白SKIP和PDZ结合激酶PBK可以和LNX结合，酵母结合试验、体外pulldown试验和体内免疫共沉淀试验验证了它们的相互作用。用荧光共聚焦显微镜观察发现，LNX蛋白可以分别和Numb蛋白、SKIP蛋白和PBK蛋白共定位于细胞核。我们推测，LNX蛋白可能通过其PDZ结构域募集相关蛋白到特定的细胞内区域组成蛋白复合体，参与包括Notch途径在内的信号传导途径。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：Q987
【部分图文】：

人LNX蛋白与小鼠Lnx蛋白氨基酸同源比较结果

3 LNX 的表达谱分析3.1 Northern 表达谱分析用 LNX 基因特异引物从 pBS-LNX建库质粒中扩增得到 1.8 kb 的 PCR 产物 用随机引物标记法掺入同位素制成 LNX 基因特异性探针 将此探针对Clontech 公司 MTN I 膜进行杂交 杂交结果用磷屏放射自显影后用 CyclonStorage Phosphor System 扫描磷屏 图 6 根据杂交信号在不同组织中的强弱程度 我们推断人类 LNX 基因 mRNA 在脑 胎盘肾脏以及胰脏这些组织中的表达量较高 在图 6 中可以看到存在 3 种转录本 大小分别为 2.6 kb 2.8 k和 4.0 kb 提示 LNX 基因可能存在 3 种剪接形式 2.6 kb 和 4.0 kb 的转录本在脑组织中存在 而在心脏 胎盘 肾脏和胰脏中则表达 2.8 kb 的转录本 LNX在脑组织中的表达特殊性显示其有可能在脑中起重要作用 值得注意的是 4.0 k图 5. 人 LNX 基因的染色体结构示意图

蛋白与 PBK 蛋白相互作用的验证了验证酵母双杂交得到的相互作用蛋白在体外是否可以和 L预吸附有纯化的 GST GST-PBK 融合蛋白的 Santa Cruz的表达有 MBP-PDZ1 的细菌破菌上清共置过夜 将 GST-AgaDS-PAGE电泳分离后电转印 PVDF 膜上 然后用 New Eng 多克隆抗体进行 Western 检测 在 PVDF 上对应 MBP-PD现一条分子量约为 50 kDa 的明显条带 与 MBP-PDZ1 的预互吻合 图 15 而在 GST 的对应位置则没有对应条带 X蛋白可以通过其 PDZ1 结构域与 PBK 蛋白特异性结合真核表达 Numb 蛋白与(1) MBP, (3) MBP- LNX, (4) MBP-LNX-Nter合实验结果 转染 Numb 的 HEK293 细胞全细胞裂解液(2)作为对照
【共引文献】

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2 朱长庚;;星形胶质细胞[J];解剖学报;1990年04期

3 曾宪智,康仲涵,张更;胎儿侧脑室室管膜发育的免疫组织化学和电镜研究[J];解剖学杂志;2004年04期

4 李雪玲;第Ⅵ类中间丝蛋白—Nestin[J];细胞生物学杂志;2003年01期

本文编号：2876771