DPP-Ⅳ抑制剂—异槲皮苷促进2型糖尿病模型小鼠胰岛素分泌及降糖作用的研究

发布时间：2020-11-09 18:01

　　 糖尿病是一种以高血糖为主要特征的内分泌代谢疾病，主要分为1型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病）和2型糖尿病两种类型（非胰岛素依赖型糖尿病），其中2型糖尿病占发病总数的80%～90%，病因主要是组织对胰岛素抵抗、胰岛素敏感性下降和胰岛β细胞分泌胰岛素相对不足。 胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Polypep Tide1, GLP-1)是食物在肠道内的消化吸收过程中，刺激肠道内分泌细胞产生的，由30个氨基酸残基组成。GLP-1的生理功能主要包括促进胰岛素的分泌、胰岛β细胞增殖并抑制其凋亡、减缓胃的排空、抑制餐后胰高血糖素的分泌、减少肝糖元的合成、提高胰岛素的敏感性以及控制食欲等。临床研究显示，GLP-1及其类似物在2型糖尿病的治疗过程中具有重要的应用价值，其通过增加胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的释放调节患者体内的血糖浓度。因此，GLP-1作为一种安全、有效的促胰岛素分泌物越来越受到关注。但是，GLP-1被体内的二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV, DPP-IV)降解的速度非常快，其半哀期很短，仅1～2min，内源性GLP-1分泌量不足的情况下不能积累达到激动GLP-1受体(GLP-1R)的剂量，故难以应用于临床。因此，研发一种安全、有效的DPP-IV抑制剂是目前2型糖尿病药物开发的一个新热点。 二肽基肽酶IV (Dipeptidyl Peptidase IV, DPP-IV)又称CD26，是由科学家Glenner和Hopsu-Havu在鼠肝脏组织匀浆过程中发现的一种位于细胞表面的丝氨酸肽酶(Serine Peptidase)，广泛表达于哺乳动物组织中，其催化活性中心位于胞外分子的C末端区域，DPP-IV能够特异性地裂解GLP-1的N端二肽残基：Xaa2Pro(Proline)或Xaa2Ala (Alanine)(Xaa为任意氨基酸)，是体内、外主要促使GLP-1降解、失活的关键酶之一。DPP-IV抑制剂的结构与DPP-IV的天然底物相似，含有Xαα-Pro类似结构，可以竞争性地结合DPP-IV的活化部位，但其亲和力却远大于它的天然底物，从而改变DPP-IV的构象，降低其催化活性。 2006年10月由默克公司研制成功的磷酸西格列汀(Sitagliptin)是最早获得FDA审批，并且作为DPP-IV抑制剂上市的治疗2型糖尿病的药物，该药显示出较好的降糖效果。但是磷酸西格列汀是化学合成药物，价格较昂贵，供货量少，且存在着较大的副作用，如可能出现超敏反应、肝酶升高、上呼吸道感染、鼻咽炎、过敏反应、血管性水肿和剥脱性皮肤损害、皮疹、荨麻疹和胰腺炎。因此，筛选出一种有效，经济，安全的DPP-IV抑制剂显得尤为重要。 我们以编码DPP-IV催化结构域(△DPP-IV)的cDNA质粒PMD18为模板，通过PCR反应扩增DPP-IV催化结构域基因，然后将其克隆到pGex-HisC3载体中，并将重组质粒转入大肠杆菌Rosstta DE3plysS中，加入IPTG诱导表达，最后通过亲和层析方法获得了△DPP-IV蛋白。 我们采用发色底物法建立了DPP-IV酶活性分析体系，检测纯化后的△DPP-IV酶的纯度达90%以上，活力为4.2U/mg，酶反应动力学显示在前20分钟内该酶显示了良好的线性关系。从现有的47种中药单体化合物中筛选△DPP-IV酶的抑制剂，在每种单体化合物终浓度为1mmol/L的情况下，抑制效果达到80%以上的单体化合物有两种，其中异槲皮苷对DPP-IV酶的抑制效果最好，达到了98.1%，测定其对△DPP-IV的IC50为96.8μmol/L，同时通过双倒数作图法研究发现异槲皮苷对△DPP-IV的抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki为236μmol/L。 从细胞水平上检测了异槲皮苷刺激NCI-H716细胞分泌GLP-1的影响。不同浓度的异槲皮苷溶液和磷酸西格列汀溶液(10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)刺激人肠道内分泌细胞NCI-H716细胞系不同时间(6h、24h、48h和72h)，结果显示，随着异槲皮苷和磷酸西格列汀浓度的升高和刺激时间的延长GLP-1的分泌量逐渐增多，但异槲皮苷对GLP-1的刺激效果更明显。 在动物水平上，我们选用了8周龄、体重约20g的昆明小鼠，采用腹腔注射浓度为35mg/kg/day STZ辅以高脂高糖饲料喂养的方式诱导2型糖尿病小鼠模型的建立，连续注射STZ三天后，小鼠的血糖上升到22.43mmol/L≥11.1mmol/L，即建模成功。小鼠按体重和血糖值随机分为6组：正常组、模型组、异槲皮苷低剂量给药组(20mg/kg)、中剂量给药组(40mg/kg)、高剂量给药组(80mg/kg)和阳性药物磷酸西格列汀组(20mg/kg)，每天观察饮水量及尿量，每周记录体重及血糖浓度的变化。连续给药8周后，结果显示，从外观上来看，正常组小鼠饮食饮水尿量正常，体重增长快，皮毛有光泽，活动灵活；模型组小鼠多饮多食多尿症状明显，体重减轻，皮毛竖立无光泽，精神萎靡，反应迟钝，异槲皮苷给药组小鼠一般情况均好于模型组，其中高剂量给药组(80mg/kg)小鼠整体状况较好，多饮多食多尿症状减轻，磷酸西格列汀给药组小鼠状况良好。体重方面，模型组小鼠体重下降，异槲皮苷给药组小鼠体重与灌胃前体重有明显上升(p0.001)，磷酸西格列汀给药组小鼠体重与灌胃前相比明显上升(p0.001)。血糖方面，与模型组相比，给药组小鼠血糖浓度明显下降，其中高剂量组（80mg/kg)小鼠血糖浓度下降明显，下降到14.8mmol/L(p0.001)；磷酸西格列汀给药组血糖浓度下降到17.4mmol/L(p0.001)，说明异槲皮苷具有明显的降血糖效果。在葡萄糖耐受实验(OGTT)中，结果显示，与模型组相比，给药组血糖浓度明显降低，即中剂量、高剂量(40mg/kg、80mg/kg)异槲皮苷给药组和磷酸西格列汀给药组能明显拮抗外源葡萄糖引起的血糖升高，低剂量(20mg/kg)异槲皮苷给药组也能降低外源性葡萄糖引起的血糖升高，但并不明显，这说明异槲皮苷能够调节糖尿病小鼠体内的血糖。异槲皮苷对血清中的DPP-IV活性具有明显的抑制作用。而在连续给药8周后，与模型组相比，给药组小鼠体内的甘油三酯和总胆固醇值变化并不明显。从体内GLP-1的分泌情况来看，在未给予葡萄糖灌胃时，给药组小鼠空腹血清GLP-1浓度明显高于模型组，在给予2g/kg体重葡萄糖后的10min时，小鼠体内的GLP-1分泌量明显增多，达到峰值，其中与模型组相比，高剂量组(80mg/kg)和磷酸西格列汀组的GLP-1分泌量增多(p0.001)。而在给予葡萄糖后的20min时，小鼠体内的胰岛素分泌量达到高峰，其中，模型组小鼠体内的胰岛素分泌偏少，异槲皮苷高剂量组(80mg/kg)和磷酸西格列汀组的小鼠体内胰岛素分泌量明显增多(p0.001)。小鼠处死后，取胰腺组织，通过HE染色的方法观察小鼠胰岛细胞的形态。结果显示，正常组小鼠胰岛细胞数量多，腺管完整清晰可见，细胞形态饱满，胞质丰富浅染，而模型组小鼠胰岛明显萎缩，胰岛细胞不完整，细胞界限模糊；与模型组相比，异槲皮苷给药组和磷酸西格列汀组小鼠胰岛病理切片腺管部分恢复饱满充盈状态，细胞排列规则，细胞形态完整，尤其是高剂量(80mg/kg)给药组，胰腺细胞形态基本恢复到正常组水平。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R-332;R587.1
【部分图文】：

图 1.1 我国各类型糖尿病患者分布比例图.1.1 The distribution proportion diagram of various types of diabetes inChina糖尿病的并发症糖尿病并发症是一种常见的慢性并发症，是由糖尿病病变而来的，将会重的后果。常见的糖尿病并发症包括足病（足部坏疽、截肢）、酮症酸病（肾功能衰竭、尿毒症）、高血糖高渗状态、眼部并发症（模糊不清）、乳酸性酸中毒、脑病（脑血管病变）、低血糖症、脂质代谢异常、心发症、高血压、神经系统并发症、胃轻瘫和皮肤病等是糖尿病最常见的，也是导致糖尿病患者死亡的主要因素如图 1.2 所示:

图 1.2 糖尿病的并发症Fig.1.2 Diabetic complication糖尿病并发症的发病机理：糖尿病的慢性并发症，即糖、尿为治疗糖尿病的核心和重点，由于传病治疗是把重点放在血糖、血压上，导致糖尿病并发症一直没有得到制和治疗。研究发现糖尿病这些并发症的病理原因是对应器官的血管病变，只是肾、眼、足病是以微小血管为主，脑、心脏病则是以中血但其病理基础都是一样的，即动脉粥样硬化。而导致动脉硬化的直接脂的多少，尤其是高密度脂蛋白（HDL）的多少和氧化的低密度脂x-LDL）的情况，而不在于血糖的高低。糖尿病足是指与局部神经异常或是下肢远端外周血管病变相关的足感染或是深层组织被破环。在发达国家糖尿病患者中，大约 5%-10%患者有不同程度足溃烂症状，而 1%的糖尿病患者因此被截肢，目前

游离脂肪酸升高容易导致胰岛素抵抗；（2）细胞因子，肥胖、氧化应激等状况的影响下容易产生的一些细胞因子，包括瘦素（Leptin）、视黄醇-结合蛋白-4（RBP-4）、脂联素（Adiponectin）白介素-6（IL-6）、纤维蛋白溶酶原活化物抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1）、抵抗素（Resistin）、α 肿瘤坏死因子（TNF-α）和皮质醇等，这些细胞因子对胰岛素信号通路具有阻碍作用，肥胖时脂肪组织产生的细胞因子为引起全身性胰岛素抵抗及 β 细胞分泌功能障碍的重要原因[31-33]。此外，涉及胰岛 β 细胞分泌胰岛素功能及靶组织对胰岛素敏感性的多种相关基因在环境因素的作用下也容易导致 2 型糖尿病。总之，2 型糖尿病的发病原因是由于个体热量的摄入过多、消耗的能量不足，导致脂肪增多、体重增加，大量的单核细胞聚集在脂肪组织内，从而刺激脂肪细胞形成炎症组织，细胞因子分泌发生变化，导致能量代谢发生障碍[34]。2 型糖尿病的发病机制如图 1.3 所示：
【参考文献】

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4 荣蓉,陈宇红,赵咏桔,胡仁明,宁光,罗邦尧,许曼音;2型糖尿病磺脲类失效的强化胰岛素治疗——胰岛素有效剂量及相关因素分析[J];中国糖尿病杂志;2001年01期

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1 张瑞;苦荞黄酮及其降血糖活性研究[D];中国农业科学院;2008年

本文编号：2876788