比较蛋白质组定量分析及其在疾病研究中的应用

发布时间：2020-11-14 01:12

　　 蛋白质组学技术是生命科学中的分析化学的主要内容,是当前的研究前沿,是化学生物学近年来的新研究方向。本论文工作是在建立蛋白质组研究实验室的过程中,建立和发展了蛋白质组、比较蛋白质组和定量蛋白质组研究的相关技术平台,并将其应用于人类重大疾病的研究。 定量蛋白质组学是通过某种方法或技术,对生物样品(细胞、组织或体液等)在某些过程中蛋白质的含量进行比较分析。从蛋白质组水平上对基因表达进行准确的定量分析,是比较蛋白质组学的重要内容,是当前研究重大疾病致病机制以及药理控制机制的必要手段及研究前沿。 本论文工作的主要贡献是,建立了一套稳定可靠的蛋白质顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台;建立了一种新的、基于肽段乙酰基化的稳定同位素标记定量蛋白质组分析技术,并在实际生物样品体系中进行了验证;将建立、优化的蛋白质组定量分析技术应用于动脉粥样硬化、冠心病以及肝癌的复发转移相关的多个实际生物样品的比较分析,并从分子水平上评价了几种药物的药效。本文还研究了对基于生物素-抗生物素蛋白特异性结合的亲和色谱分离体系,结果显示该体系有望实现与乙酰基化同位素标记技术的有效对接,建立新的定量分析技术。 一、在优化和发展传统双向凝胶电泳蛋白质组、比较蛋白质组方法的基础上,建立了蛋白质组顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台,为蛋白质组学方法学研究和应用研究奠定了实验基础 鉴于蛋白质组的高度复杂性,在进行双向凝胶电泳前对蛋白质进行预分组是十分必要的。顺序提取按蛋白质溶解能力的不同将复杂的蛋白质组预分组,是目前常用的比较有效的样品预分组的方法之一。如何根据实验需求合理选择不同溶解能力的顺序提取液,不同的蛋白质提取液可否直接进行双向凝胶电泳分离并得到良好的分离效果等问题,是影响蛋白质组分析的重要因素。 本论文提出了一套完整的蛋白质三步提取方案,可以确保几乎所有的蛋白质进入相应的溶液中。其中,T1体系 (1 mmol/L PMSF的水溶液) 由于不含任何的蛋白质去垢剂、变性剂等,背景溶液组成简单,可以很方便地采取各种色谱分离的手段进行分离,也可以在直接补加一定量的蛋白质去垢剂、变性剂后采用双向凝胶电泳进行分离;T2 (7 mol/L 尿素,2 mol/L硫脲,2% CHAPS,2% SB3-10, WP=7 50 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF) 背景溶液的组成与双向凝胶电泳分离的缓冲体系相容性较好,因此可以利用双向凝胶电泳优越的分离能力和直观的检测方式直接对E2进行分离分析。由于高丰度蛋白质多存在于胞浆中,可溶性较好,E2中大量高丰度蛋白质已被提取,间接提高了上样量,使一些中、低丰度的蛋白质得到检测,提高了蛋白质的检出率;在T2提取液的组成中加入离子性去垢剂SDS作为第三级提取液T3,将T2提取后的不溶物基本上全部溶解,同时由于SDS的存在,稀释不会导致蛋白质的析出,通过稀释,可以直接采取多维色谱进行分离分析。 作为该平台中联系双向凝胶电泳分离和质谱鉴定的桥梁,胶内酶解过程是影响肽段回收率的主要因素。本论文将原手工胶上酶解过程经适当调整,应用于高通量半自动酶解分析,提高了分析速度和通量;实验考察了对半自动胶上酶解过程中严重影响肽段回收率和蛋白质鉴定的确定性的诸多环节,包括酶液使用量的多少、酶解时间的长短、是否去盐等问题,优化了实验参数。即当用96孔板酶解一粒直径1.4 mm的胶粒时,使用3 ?l的胰蛋白酶液(12.5 ng/?l)足以使其完全酶解,酶解时间长(酶解过夜)有助于得到较多的肽段,胶上酶解所得的肽段是否去盐对质谱分析所得的谱图质量的影响,主要取决于肽段溶液中含盐量及溶液中肽段的相对多少等等。 二、双向凝胶电泳-质谱鉴定定量蛋白质组学在疾病研究中的应用 本论文应用双向凝胶电泳-质谱鉴定比较蛋白质组的方法对心血管、肝癌等两类重大疾病相关的细胞系或组织的蛋白质组进行了比较分析,奠定了致病过程中关键蛋白质筛选的基础,结果对药物的研发、药效的评价也具有指导意义。 1、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)泡沫细胞模型比较蛋白质组研究。AS是心脑血管疾病的共同病理基础,而泡沫细胞是AS斑块内出现的特征性病理细胞。AS早期,单核细胞首先粘附于血管内皮,然后迁移至内皮下分化为巨噬细胞,后者主要通过清道夫受体无节制地吞噬大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),形成巨噬源性泡沫细胞,进而堆积成AS斑块。 利用双向凝胶电泳对正常巨噬细胞、泡沫细胞进行了差异蛋白质组分析。对其中26个高表达蛋白质点及11个差异蛋白质点进行手工胶上酶解,1D LC-ESI/MS鉴定;对鉴定出的差异蛋白质按功能进行了归类,并讨论了其在泡沫细胞形成过程中可能的作用。研究了具有抗AS功效的银杏叶提取物(GbE)、香豆素提取单体(IMP)作用后泡沫细胞蛋白质组的变化情况。通过比较分析双向凝胶电泳分离所得的图谱,发现两种药物对差异蛋白质皆有一定的回调作用,但 WP=8 回调的蛋白质种类和程度却不完全相同,提示两种药物的抗AS作用在机制上存在差异。本工作用双向凝胶电泳分离技术成功地筛选并确定了不同药物的作用靶点。 2、冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)家兔主动脉血管、肝脏组
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R341
【部分图文】：

复旦大学博士论文和自动化，故难以适应大规模、高通量分析的要求（二）稳定同位素标记定量分析技术稳定同位素标记技术（isotope labeling techniq较新也是比较准确可靠的定量分析方法。由于质谱分析过程中，肽段的离子化效率随时采用内标法补偿这种变化，以获得较为可靠的定量

以致峰的间距就会越大。通过比较质谱图中含有同位素标一对峰的相对强度，就可以判断出原细胞体系中某蛋白质表达水平的由分析原理和过程可知，该方法只是对氨基酸序列已知的肽段的分，对于未知序列肽段，由于无法得知分析肽段中确切的氨基酸的数目此难以确定其中所含氮原子的确切数目，故识别质谱图中一对分析对较困难，这也是该标记技术比较明显的缺点之一。．使用稳定同位素标记的氨基酸残基的细胞培养介质该技术又称为稳定同位素标记氨基酸介质细胞培养技术（SILAotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture），是使用含有稳定同位过的某种氨基酸残基的介质培养细胞，将稳定同位素（2H,13C,15N）氨基酸（如赖氨酸 Lys、半胱氨酸 Cys、或丝氨酸 Ser 等）在细胞培引入到细胞生长过程中所表达的蛋白质的氨基酸骨架结构中。这一技点是，在用生物质谱进行蛋白质鉴定定量分析的同时，还能够提供蛋

碘代乙酰基与巯基的特异性取代反应与蛋白质中半胱代反应，将同位素原子结合到含有半胱氨酸的肽段中。由 个氘原子取代部分，还存在生物素（biotin）部分，因此白质半胱氨酸中巯基部分的同位素标记，还可以通过基合的亲和色谱分离技术实现对已经标记过的含有半胱氨离，使分析、分离过程简化 从而减少了过程误差。具有广泛的兼容性，主要表现在：第一，能够兼容分、组织中绝大部分蛋白质；第二，烷基化反应即使在盐盐酸胍等)、蛋白质稳定剂存在下都可以进行；第三，基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分析体系的复杂性何类型的生化、免疫、物理的分离方法，因此允许使用在理论上能很好地定量分析低丰度的蛋白质。图 1-4 ICAT 试剂化学结构
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本文编号：2882877