表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究

发布时间：2020-11-18 02:08

　　 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，目前全球范围内大约有超过3.5亿人受到HBV危害。大约有15～40％的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区，现患慢性乙型肝炎的病人已突破1000万。迄今为止，慢性乙型肝炎的治疗仍无良策，因此，研制新型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒(adeno-associated vires type 2，rAAV-2)作为一种大有希望的基因转移载体，因能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此，本研究以研制新型HBV疫苗为目的，构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步研究了其免疫原性，并探讨了表达HBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—1质粒中扩增HBV(ayw亚型)外膜主蛋白(HBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因；将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒pSNAV中，构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK—21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc/ΔUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，纯化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg；用高效液相色谱仪(HPLC)检测和SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的纯度；以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度；ELISA检测混合细胞系 博士论文:，、HB、，卜膜主蛋。、、蛋。、重组腺，关病毒的构减巍免。性研究 BHK一HBsAg和BHK~LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达，rAA认HBsAg和 rA戌认LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明，H卫LC分析显 示主峰为总面积大于99%;SDS一PAGE电泳结果显示3条特征性条带，其间的 杂蛋白量非常少;点杂交检测rA戌瞬2一HBsAg和rAA认2.LHBsAg的物理滴度分 别为sxlo，‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil(vp翔吐);混合细胞株BHK一HBsAg中 HBsAg的表达量为28.6士6.7ng乃x ro6eells，BHK~LHBsAg中HBsAg的表达量 为15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌认2~HBs^g和rAAv-2~LHBsAg感染BHK一21 细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达，表达量随感染复数(伽ltiplicityof infection，MOI)的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能 有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg，为下一步工作奠定 了基础。 本文首次报道了rA戌认2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通 过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径，我们观察了rA入v-2~HBsAg 和rAA认2.LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBv抗原特异性的体 液和细胞免疫反应的能力。结果显示，rAAv-2~HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通过 肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg， 同一给药途径，rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2~LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水 平无明显差异(p0 .05);同一重组病毒(rA戌认2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg) 不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异(p0 .05)。重组病毒通过不 同途径在小鼠体内表达的同时，可在较长时间(80天)诱导小鼠产生HBV抗原 特异性的体液和细胞免疫反应:不同给药途径之间的免疫效果比较发现，肌肉注 射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲都能诱发机体产生HBV保护性抗体和激发CTL 产生，但以尾静脉注射效果最好，腹腔注射、肌肉注射和胃饲三者之间差别不大 (p0 .05);在各种给药途径中，免疫反应能否出现、以及免疫反应的强度与剂 量(给予的重组病毒颗粒数)有关。结果提示，基于rAAV载体的HBV疫苗， 对于防止HBV感染，尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗和应用于对现有 HBV疫苗无反应的患者无疑具有潜在的应用价值，值得做进一步的系统研究。 近年来，以DC为基础的免疫治疗已成为抗肿瘤和抗感染等研究的热点，本 文也探讨了表达HBV抗原基因的rAA认2载体用于DC为基础的慢性乙型肝炎免 疫治疗的可行性。首先，我们用表达报告基因一绿色荧光蛋白(GFP)基因和荧 光素酶(luciferase，Luc)的rA月认2(分别简称为rAA认GFP和rAAV-Luc)感染 了人外周血单核细胞来源DC以观测感染效能，在激光共聚焦显微镜观察了F仃C 博士论文:表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究 (fluorescein 150而Ocyanate，FITC，异硫氰酸荧光素)标记的rAA认2进入Dc的 动态过程;结果显示，激光共聚焦显微镜下观察到了rAAV-2能进入DC;只有 当Mol(multiplicity of infeetion，感染复数)大于1 X losvp/c ell时，乙AAV-2一lue 和rA戌认2一GFP才能有效感染DC，需较高的MOI值的重组病毒才能有效感染 Dc，报告基因的表达水平在MOI值为1 X 105一5 x 106vPlcell之间呈剂量依赖趋 势，此后再提高MOI值并不能明显提高表达水平，感染后的DC表达水平不高。 表明rAA认2可以有效感染DC，但转导效率?
【学位单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392
【部分图文】：

如7.6ngpSNAV的拷贝数=7.6x10一gx6.oZ=10X10812.4.7.3结果判定比较样品与标准质粒的杂交信号强度，滴度(vp/nil)=对应的拷贝数X2X100O13.rA月叭2-HBsAg和rAAV‘2·LHBsAg体外感将96孔板中60一70%满的细胞(约2一3x或DMEM)洗二次，以Mol为1x104、5x1xlo7virusp洲eleszeell(vp/cell)的rAAv-2一皿BHK一21细胞和293细胞，吸附lh后，加入含感染后第3天用ELISA试剂盒检测上清和细胞书进行操作)中HBsAg的含量。二结果(一)PCR扩增HBV主蛋白和大蛋白基因LanelLaneZLan仑3

大蛋白基因(L)，扩增区域为bp2827一865，两端分别含KPnl和Bgln酶切位点，扩增后的片段全长为1235bp。在琼脂糖凝胶上可见大小分别约为700bp和12O0bp两条DNA扩增带(图1一2)。测序结果表明，S片段和L片段与皿v(ayw亚型)相应位置的核昔酸序列完全一致。(二)pMD18一T-s和pMD18一T-L酶切鉴定结果l朋elLaneZLane3图1一3.pMD18一T-s和pMD18一T-L酶切分析Figl一3.MapofPMD18一T-SandPMD18一T-Ldigestedwithendonueleases.Lanel:PMD18一T-LdigestedwithKPn1andBgl11:LaneZ:DNAmarker口L2000);Lane3:PMD18一T-SdigestedwithEeoR1andBgl11.PCR扩增产物连接于pMD18一T后，转化DHS。，提取质粒，分别用EcoRI和Bglll、KPnl和Bglll酶切鉴定，可得到大小相符的两条DNA条带(结果见图1一3)。纯化回收后得到S片段和L片段。(三)重组质粒pSNAV.2.HBsAg和pSNAV‘2一LHBsAg的构建为建立携带外源基因的rAA协2载体细胞株，中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAA认2载体质粒psNAV-2(41)。PSNAv-2含有AAv‘2两端的仃R，中间依次为CMV立早增强子和启动子、多克隆位点和polyA信号，其中供外源基因插入的多克隆位点为EcoRI、sal、KPnl和Bglll等

KPnl和Bglll双酶切pMD18一T-L得到的L片段连接。转化DH5a，挑取其中各6个单菌落提取质粒，酶切鉴定结果表明分别得到5个和6个连接正确的重组子，分别命名为PSNA认2-HBsAg和pSNAv-2-LHBsAg(图1一4为正确的重组子酶切图)。目的基因的正向插入应分别能切下约700bp和1.2kb片段。Lan叭L。打。ZL助。3图1一4.PsNAV‘2一IIBsAg和PSNAv‘2~LHBsAg酶切鉴定图.Figl一4·IdentificationmaPofpSNAV-2一HBsAgandpSNAV-2一LHBsAgdigested.withendonucleases.Lanel:PSNAV‘2一HBsAgdigestedwithEcoR1andBgl11:LaneZ:PSNAV-2一LHBsAgdigestedwithKPn1andBgl11;Lane3:DNAmarker(DL150OO).(四)混合细胞株BHK.HBsAg和BHK·LHBsAg上清中HBsAg的检测结果将pSANV-HBsAg和pSNAV‘2一LHBsAg分别转染的BHK一21细胞在含G418的1640培养液培养九天，对照组细胞(未转染的BHK一21细胞)全部死亡，转染的细胞约死亡30%。各取扩大培养细胞一小方，用PBS洗三遍，反复冻融三次，上清用ELISA试剂盒检测HBsAg的表达，混合细胞株BHK一HBsAg表达量为25.6士6.7ng25xlo6eells，BHK一研BsAg中皿sAg的表达量为15.4士5.5ng/5x106eeUS。证明S基因和L基因能在混合细胞系中表达。(五)rA戌叭2-HBsAg和rAAV‘2·LHBsAg纯度检测结果分别以0.1的Mol的辅助病毒感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg
【参考文献】

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2 刘雁征,吴小兵,周玲,伍志坚,侯云德,曾毅;含HIV-1 gag、gag V3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究[J];病毒学报;2001年04期

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本文编号：2888211