细胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化还原电位对NAFLD肝细胞线粒体功能的影响
发布时间：2020-12-26 14:10
目的:研究细胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化还原电位（EhCys/Cy SS）对非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝细胞线粒体功能的影响。方法:用EhCys/Cy SS分别为0 m V（氧化）、-80 m V（正常）和-150 m V（还原）的氧化还原培养基培养肝细胞株LO2并采用油酸诱导细胞建立NAFLD模型。荧光探针DCFH-DA和Mito SOX分别检测细胞整体水平和线粒体活性氧簇（ROS）生成,使用apocynin（NADPH氧化酶抑制剂）和Mito Q10（靶向线粒体抗氧化剂）、rotenone（线粒体呼吸链复合体I抑制剂）和antimycin A（线粒体呼吸链复合体Ⅲ抑制剂）作用细胞检测线粒体复合体活性从而探究ROS的来源,JC-1检测细胞线粒体膜电位。结果:油酸诱导的NAFLD细胞模型使肝细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降;氧化的EhCys/Cy SS加剧了NAFLD肝细胞ROS的生成以及线粒体膜电位的下降,而还原的EhCys/Cy SS能清除ROS并逆转线粒体膜电位的下降。线粒体ROS清除剂Mito Q10能显著地减少氧化的EhCys/Cy SS所增加的ROS,而apocynin效果...
【文章来源】：中国病理生理杂志. 2015年07期 北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
EhCys/CySS对NAFLD肝细胞ＲOS生成的影响
Figure2．ThesourceofＲOSintheLO2cellstreatedwiththeoxidizedEhCys/CySS．Mean±SD．n=6．△P＜0.05，△△P＜0.01vsC(0mV);##P＜0.01vsC(－150mV);＊＊P＜0.01vsC(－80mV);++P＜0.01vsrotenone(－80mV)．图2氧化的EhCys/CySS作用下LO2细胞ＲOS的来源3氧化的EhCys/CySS抑制线粒体复合体I活性由上面的实验可知，氧化的细胞外状态下LO2细胞ＲOS主要来源于线粒体。为了进一步探究线粒体内ＲOS产生机制，实验针对线粒体呼吸链产生ＲOS的环节，选择线粒体复合体I和III的抑制剂，rotenone(2μmol/L)和antimycinA(5μmol/L)［16］。实验结果显示，2种抑制剂作用后都使细胞ＲOS生成增加;但是antimycinA孵育细胞后，各组细胞ＲOS的增加率与细胞外EhCys/CySS无关，而复合体I抑制剂rotenone作用后ＲOS的增加率与细胞外EhCys/CySS呈相关趋势，即0mV时增加了23.5%，－150mV时增加了151.6%。实验说明氧化的EhCys/CySS可能通过抑制线粒体复合体I活性来增加ＲOS的生成。使用线粒体呼吸链复合体I活性检测试剂盒进一步验证实验假设。结果显示0mV时线粒体复合体I的活性只有正常状态下细胞的42%，而－150mV时细胞复合体I活性轻微增强，实验结果进一步证明了氧化的EhCys/CySS通过抑制线粒体复合体I活性来增加ＲOS的生成，见图2。4细胞外EhCys/CySS对LO2细胞线粒体膜电位的影响如图3所示，与C组相比，油酸使OA组细胞线粒体膜电位下降，JC-1染色由红色向橙色转变，绿色荧光与红色荧光的比值由65%增长到82%(P＜0.01);与正常生理状态(－80mV)相比，氧化状态(0mV)使NAFLD肝细胞线粒体膜电位进一步下降，JC-1染色由橙色向绿色转变，绿色/红色荧光比值由82%增长到110%(P＜0.01);还原状态(－150
Figure3．TheeffectsofEhCys/CySSonthemitochondrialmembranepotentialofOAtreatedLO2cells．Mean±SD．n=6．*P＜0.05，＊＊P＜0.01vsOA(－80mV)．图3EhCys/CySS对LO2细胞线粒体膜电位的影响分子量硫醇/二硫化物物质对［1］，肥胖、糖尿并化疗、酗酒、抽烟等往往伴随着血浆中EhCys/CySS的氧化［2］，越来越多研究表明氧化的EhCys/CySS与脂质代谢性疾病的危险因素有关。Imhoff等［5］研究表明高脂饮食会导致小鼠血浆EhCys/CySS氧化，细胞实验进一步说明细胞外液氧化的EhCys/CySS能加剧脂肪细胞脂质生成，而还原的EhCys/CySS能改善脂质沉积。Thong等［17］研究发现N-乙酰半胱氨酸能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化应激和肝脂质沉积及炎症症状。而且，N-乙酰半胱氨酸作为L-cys-teine的前体，能使血浆中EhCys/CySS还原［18］。因此，血浆中氧化的EhCys/CySS可能对NAFLD发生发展起重要作用。本研究通过细胞实验，以Cys、CySS和Cys-freeDMEM培养基模拟人体氧化、正常和还原的细胞外环境培育LO2细胞并以油酸建立NAFLD模型。研究中发现油酸NAFLD模型能使细胞ＲOS增加线粒体膜电位降低，而氧化的EhCys/CySS(0mV)加剧了ＲOS的生成并使线粒体膜电位进一步下降，还原的EhCys/CySS(－150mV)能清除ＲOS并纠正降低的膜电位。线粒体ＲOS清除剂MitoQ10显著减少了由氧化EhCys/CySS所增加的ＲOS。线粒体复合体I抑制剂rotenone作用于细胞后，ＲOS的增长率与细胞外EhCys/CySS有关，0mV时ＲOS的增长率很小并且线粒体复合体I活性减弱。实验说明，对于高脂培养的LO2肝细胞，细胞外液氧化的EhCys/CySS能通过抑制线粒体复合体I加剧肝细胞ＲOS的生成，并使线粒体
【参考文献】：
期刊论文
[1]mfn2基因转染对非酒精性脂肪肝细胞线粒体功能的影响[J]. 张勇,胡文君,王尧,夏耘,郑启昌. 中国病理生理杂志. 2010(03)
[2]N-acetylcysteine attenuates oxidative stress and liver pathology in rats with non-alcoholic steatohepatitis[J]. Duangporn Thong-Ngam,Suchittra Samuhasaneeto,Onanong Kulaputana,Naruemon Klaikeaw. World Journal of Gastroenterology. 2007(38)
本文编号：2939848
【文章来源】：中国病理生理杂志. 2015年07期 北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
EhCys/CySS对NAFLD肝细胞ＲOS生成的影响
Figure2．ThesourceofＲOSintheLO2cellstreatedwiththeoxidizedEhCys/CySS．Mean±SD．n=6．△P＜0.05，△△P＜0.01vsC(0mV);##P＜0.01vsC(－150mV);＊＊P＜0.01vsC(－80mV);++P＜0.01vsrotenone(－80mV)．图2氧化的EhCys/CySS作用下LO2细胞ＲOS的来源3氧化的EhCys/CySS抑制线粒体复合体I活性由上面的实验可知，氧化的细胞外状态下LO2细胞ＲOS主要来源于线粒体。为了进一步探究线粒体内ＲOS产生机制，实验针对线粒体呼吸链产生ＲOS的环节，选择线粒体复合体I和III的抑制剂，rotenone(2μmol/L)和antimycinA(5μmol/L)［16］。实验结果显示，2种抑制剂作用后都使细胞ＲOS生成增加;但是antimycinA孵育细胞后，各组细胞ＲOS的增加率与细胞外EhCys/CySS无关，而复合体I抑制剂rotenone作用后ＲOS的增加率与细胞外EhCys/CySS呈相关趋势，即0mV时增加了23.5%，－150mV时增加了151.6%。实验说明氧化的EhCys/CySS可能通过抑制线粒体复合体I活性来增加ＲOS的生成。使用线粒体呼吸链复合体I活性检测试剂盒进一步验证实验假设。结果显示0mV时线粒体复合体I的活性只有正常状态下细胞的42%，而－150mV时细胞复合体I活性轻微增强，实验结果进一步证明了氧化的EhCys/CySS通过抑制线粒体复合体I活性来增加ＲOS的生成，见图2。4细胞外EhCys/CySS对LO2细胞线粒体膜电位的影响如图3所示，与C组相比，油酸使OA组细胞线粒体膜电位下降，JC-1染色由红色向橙色转变，绿色荧光与红色荧光的比值由65%增长到82%(P＜0.01);与正常生理状态(－80mV)相比，氧化状态(0mV)使NAFLD肝细胞线粒体膜电位进一步下降，JC-1染色由橙色向绿色转变，绿色/红色荧光比值由82%增长到110%(P＜0.01);还原状态(－150
Figure3．TheeffectsofEhCys/CySSonthemitochondrialmembranepotentialofOAtreatedLO2cells．Mean±SD．n=6．*P＜0.05，＊＊P＜0.01vsOA(－80mV)．图3EhCys/CySS对LO2细胞线粒体膜电位的影响分子量硫醇/二硫化物物质对［1］，肥胖、糖尿并化疗、酗酒、抽烟等往往伴随着血浆中EhCys/CySS的氧化［2］，越来越多研究表明氧化的EhCys/CySS与脂质代谢性疾病的危险因素有关。Imhoff等［5］研究表明高脂饮食会导致小鼠血浆EhCys/CySS氧化，细胞实验进一步说明细胞外液氧化的EhCys/CySS能加剧脂肪细胞脂质生成，而还原的EhCys/CySS能改善脂质沉积。Thong等［17］研究发现N-乙酰半胱氨酸能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化应激和肝脂质沉积及炎症症状。而且，N-乙酰半胱氨酸作为L-cys-teine的前体，能使血浆中EhCys/CySS还原［18］。因此，血浆中氧化的EhCys/CySS可能对NAFLD发生发展起重要作用。本研究通过细胞实验，以Cys、CySS和Cys-freeDMEM培养基模拟人体氧化、正常和还原的细胞外环境培育LO2细胞并以油酸建立NAFLD模型。研究中发现油酸NAFLD模型能使细胞ＲOS增加线粒体膜电位降低，而氧化的EhCys/CySS(0mV)加剧了ＲOS的生成并使线粒体膜电位进一步下降，还原的EhCys/CySS(－150mV)能清除ＲOS并纠正降低的膜电位。线粒体ＲOS清除剂MitoQ10显著减少了由氧化EhCys/CySS所增加的ＲOS。线粒体复合体I抑制剂rotenone作用于细胞后，ＲOS的增长率与细胞外EhCys/CySS有关，0mV时ＲOS的增长率很小并且线粒体复合体I活性减弱。实验说明，对于高脂培养的LO2肝细胞，细胞外液氧化的EhCys/CySS能通过抑制线粒体复合体I加剧肝细胞ＲOS的生成，并使线粒体
【参考文献】：
期刊论文
[1]mfn2基因转染对非酒精性脂肪肝细胞线粒体功能的影响[J]. 张勇,胡文君,王尧,夏耘,郑启昌. 中国病理生理杂志. 2010(03)
[2]N-acetylcysteine attenuates oxidative stress and liver pathology in rats with non-alcoholic steatohepatitis[J]. Duangporn Thong-Ngam,Suchittra Samuhasaneeto,Onanong Kulaputana,Naruemon Klaikeaw. World Journal of Gastroenterology. 2007(38)
本文编号：2939848
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