冠状病毒甲基转移酶抑制剂筛选平台及其反向遗传学系统的建立

发布时间：2021-01-04 08:19

　　高等真核生物细胞信使RNA （mRNA）及一些病毒RNA的5’-端均具有N7或者2’-O甲基化修饰的帽子结构。同时,5’端的帽子修饰具有很多重要的生物学功能：保护信使RNA避免被5’外切酶降解；指导前体信使RNA的剪切及核输出；保证信使RNA的稳定性及有效的翻译。除此以外,2’-O帽子修饰已被证明可以帮助冠状病毒逃避胞内识别病毒双链RNA的受体MDA5（melanoma differentiation-associated gene5）的识别及干扰素诱导蛋白IFIT （IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats）介导的免疫抑制。由于病毒本身的加帽过程、机制与细胞内信使RNA的加帽存在很大差别,使病毒加帽酶作为抗病毒药物靶标成为可能。目前冠状病毒加帽酶抑制剂筛选平台的建立及冠状病毒甲基化修饰与免疫逃逸之间的关系成为研究的热点。本研究中,我们在酵母菌功能互补遗传系统之上构建了抑制酵母细胞生长的冠状病毒加帽抑制剂筛选平台。该平台以96、384微孔板作为筛选工具,通过吸光值法直接测定表达冠状病毒非结构蛋白14（Coronavirus ... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：138 页

【学位级别】：博士

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本论文的创新点
摘要
Abstract
引言
第一部分 概述冠状病毒及其反向遗传学系统和加帽修饰
    1 冠状病毒
        1.1 冠状病毒造成的疾病
            1.1.1 人冠状病毒
            1.1.2 鼠冠状病毒
        1.2 冠状病毒
            1.2.1 冠状病毒的分类
            1.2.2 冠状病毒基因组及病毒粒子
            1.2.3 冠状病毒的生活周期
            1.2.4 冠状病毒的复制
            1.2.5 病毒蛋白
        1.3 冠状病毒的反向遗传学
            1.3.1 定向重组
            1.3.2 从cDNA中重新形成病毒的反向遗传学系统
        1.4 冠状病毒与先天免疫逃逸
            1.4.1 宿主抗病毒先天免疫及对SARS-CoV感染的反应
            1.4.2 SARS-CoV通过DMVs保护及加帽修饰逃逸宿主先天免疫的识别
        1.5 抗冠状病毒药物研究进展
            1.5.1 抗冠状病毒药物
            1.5.2 冠状病毒疫苗
    2 mRNA加帽机制及其功能酶研究概要
        2.1 5’末端帽子的结构、功能及加帽过程
        2.2 加帽修饰相关功能酶简介
            2.2.1 RNA三磷酸酶的结构与作用机制
            2.2.2 鸟苷酸转移酶的结构与作用机制
            2.2.3 甲基转移酶的结构和作用机制
        2.3 生物体内参与加帽过程的酶组成
        2.4 病毒的加帽机制
            2.4.1 病毒传统的加帽修饰方式
            2.4.2 病毒非传统的加帽方式
        2.5 病毒加帽修饰与先天免疫
        2.6 针对加帽酶的抑制剂
            2.6.1 三磷酸酶抑制剂
            2.6.2 鸟苷酸转移酶抑制剂
            2.6.3 甲基化转移酶抑制剂
        2.7 甲基供体SAM的基本特性
第二部分 冠状病毒甲基转移酶抑制剂的筛选
筛选冠状病毒甲基转移酶抑制剂">    3 酵母菌功能性互补及酵母生长抑制系统的构建_筛选冠状病毒甲基转移酶抑制剂
        3.1 研究背景概述
        3.2 实验材料
            3.2.1 实验仪器
            3.2.2 菌种及质粒
            3.2.3 工具酶、试剂盒及试剂
            3.2.4 相关溶液
        3.3 实验方法、原理
            3.3.1 引物设计
            3.3.2 酵母菌表达质粒及原核表达质粒的构建
            3.3.3 DNA目的片段扩增及质粒DNA的实验操作
            3.3.4 酵母表达质粒的转化
            3.3.5 转化酵母菌在5-FOA上的筛选
            3.3.6 冠状病毒nsp14的体外表达、纯化、活性测试及药物抑制
        3.4 实验结果及讨论部分
            3.4.1 所有冠状病毒nsp14都能互补酵母N7-MTase的功能
            3.4.2 对数生长期内吸光值法能准确反映酵母细胞的数目
            3.4.3 体外生化检测药物对冠状病毒N7-MTase活性的影响
            3.4.4 以酵母遗传学为基础冠状病毒N7-MTase抑制剂筛选平台的建立
            3.4.5 检测酵母遗传学为基础的筛选平台的有效性
            3.4.6 蹄选抑制冠状病毒N7-MTase的天然化合物药库
            3.4.7 优化冠状病毒N7-MTase抑制剂的筛选体系
第三部分 鼠肝炎冠状病毒反向遗传学系统的建立
    4 重组突变鼠肝炎冠状病毒的构建
        4.1 研究背景概述
        4.2 实验材料
            4.2.1 实验仪器
            4.2.2 病毒、菌种及质粒
            4.2.3 实验用耗材
        4.3 实验方法及原理
            4.3.1 引物设计
            4.3.2 以痘苗病毒为载体的全长MHV重组病毒（V.V-inf-1）的扩增及噬斑分析
            4.3.3 pGPT-out-nsp14同源重组质粒的构建
            4.3.4 痘苗病毒介导的同源重组
            4.3.5 GPT双向筛选
            4.3.6 重组痘苗病毒DNA的提取及PCR鉴定
            4.3.7 GPT-Out重组痘苗病毒DNA的提取、酶切与体外转录
            4.3.8 突变MHV基因组全长RNA的转染及拯救
            4.3.9 MHV突变体的纯化与鉴定
            4.3.10 MHV突变体生长曲线的测定
        4.4 实验结果及讨论
            4.4.1 重组痘苗病毒V.V-MHV-A59 nsp14-gpt in的增殖及滴度测定
            4.4.2 鼠肝炎冠状病毒基因组DNA的定向突变
            4.4.3 MHV突变体的拯救
            4.4.4 MHV-nsp14-mutants的增殖、噬斑分析及温度敏感性测试
            4.4.5 MHV-nsp14-mutants生长曲线的测定
    5 讨论与展望
参考文献
研究生期间发表论文
致谢



本文编号：2956459