成体肝间充质样干细胞的分离培养与体外成肝细胞诱导分化

发布时间：2017-04-12 13:10

  本文关键词：成体肝间充质样干细胞的分离培养与体外成肝细胞诱导分化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的 理想的肝细胞材料是进行药物检测、肝细胞移植治疗以及生物人工肝等应用的基础。但由于新鲜肝细胞来源匮乏,成熟肝细胞无法在体外增殖且体外培养易丧失其分化状态等问题,寻找可供应用的肝细胞材料成为多年来科学家们致力解决的难题。 除成熟原代肝细胞外,应用较多的传统肝细胞源主要是肿瘤来源永生化细胞系、胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)。其中,各种肿瘤来源的永生化细胞系具有增殖迅速、可以冷冻储存并无限传代的特性,但肿瘤源性细胞以及各种通过基因工程技术加工的细胞系,存在潜在的致瘤危险,较低的安全系数限制了其在临床中的应用。ESCs为具有全能性及无限增殖能力的原始细胞群,但其来源受限,一直存在着一定的伦理学争议,加之培养费用高昂,细胞分化状态不稳定,使其难以大规模应用。iPSCs是通过基因工程技术将体细胞重构得到的诱导多潜能干细胞；但同ESCs一样,其致畸胎瘤形成的潜在可能性成为制约其临床应用的主要障碍。据FDA报道,畸胎瘤形成的安全隐患,成为制约干细胞再生医学应用的主要障碍。 近年来,许多学者开始了对成体干细胞(ASC)的研究。ASC是存在于人和动物已分化组织中的具有自我更新和增殖能力以及(多向)分化潜能的细胞。ASC通常处于静息状态,在适当的条件下,可激活并向特定组织器官分化；ASC的获取与分离伦理学争议少、且为正常细胞来源,未经过基因改造,安全性高[2]。目前研究较多的为骨髓造血干细胞、表皮干细胞、以及脂肪干细胞等。研究显示,骨髓造血干细胞可经体外诱导分化成为具有某些肝细胞特异性功能的肝样细胞,但其诱导效率仍然较低,分化后形成的肝样细胞功能低下[3-5]。 由于以上细胞依然无法提供理想的肝细胞来源,近年来,有学者开始寻找是否存在肝脏来源的成体干细胞。有研究报道成功从受损的大鼠肝脏(如重度肝纤维化或是慢性肿瘤)成功分离出干细胞样具有体外分裂能力的细胞；也有研究报道健康大鼠成熟肝细胞可在体外去分化形成祖细胞[6]。 在既往研究基础上,本研究旨在寻找一种更为安全可靠、且特异性功能好的肝细胞源。实验致力于从健康成年大鼠肝脏中分离出成体肝间充质样干细胞(简称成体肝干细胞,r-LMSC),进一步对rALMSC进行体外成肝细胞诱导分化,并对分化后形成的肝样细胞(rALMSC--H)进行生物学特性、代谢功能的检测与评价,并使用rALMSC-H对肝细胞毒性药物进行药物测试,以评价其应用价值。 方法 1、成体肝间充质样干细胞(rALMSC)的分离与培养。使用含有10%胚胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养液培养原代肝细胞,直至成体肝干细胞开始生长并增殖；当成体肝干细胞生长至覆盖培养瓶90%面积时,将细胞用0.25%的胰酶进行消化、传代。 2.rALMSC的鉴定。使用细胞免疫荧光对细胞性质进行鉴定,鉴定细胞是否表达VIM、α-SMA.进一步使用流式细胞术对rALMSC细胞表面标志进行鉴定,鉴定标志包括间充质干细胞标志CD29、CD44、CD90,造血干细胞标志CD45,以及肝细胞特异性标志ASGPR. 3、体外诱导成体肝干细胞(rALMSC)向肝细胞的分化。诱导分化共分为三个阶段：预分化阶段、诱导分化阶段以及诱导成熟阶段。预分化阶段使用EGF、FGF-4培养2天,分化阶段使用FGF-4、HGF培养7天,成熟阶段使用HGF、OSM培养7天。 4、分化后肝样细胞(rALMSC-H)形态学及生物学功能的检测。在倒置相差显微镜下观察rALMSC分化至rALMSC-H的形态学变化；使用细胞免疫荧光鉴定分化后rALMSC-H是否表达ALB；采用qRT-PCR法检测rALMSC-H的肝细胞特异性功能及相关蛋白的基因表达情况；使用Urea Nitrogen Kit检测rALMSC-H培养上清尿素氮分泌情况；使用液相色谱-质谱分析仪对分化前rALMSC、分化后rALMSC-H以及新鲜成熟大鼠肝细胞的细胞培养上清液进行分析,检测其细胞色数P450(CYP1A2)活性。 5、使用rALMSC-H进行药物诱导肝细胞毒性测试。使用不同浓度扑热息痛、双氯芬酸、酮康唑、氯丙嗪、奎尼丁以及氟他胺作用于rALMSC-H以及成熟肝细胞,24小时后运用MTS检测细胞活性,并进行比较。 6、统计分析。统计学方法采用SPSS13.0软件,组间差异采用两样本的t检验,P0.05被认为差异有统计学意义。 结果 1、成体肝干细胞(rALMSC)的分离与培养。分离获得典型梭形或纺锤形的间充质样rALMSC,细胞可在体外快速增殖、传代。第三代后,为纯化的rALMSC。 2、rALMSC的鉴定。rALMSC表达VIM及α-SMA;间充质干细胞表面标记物CD29、CD44、CD90阳性,肝细胞表面标记物ASGPR及造血干细胞表面标记物CD45阴性。 3、分化后rALMSC-H形态学变化。rALMSC在体外被诱导向肝细胞分化过程中,逐渐失去其原有长梭形形态,转变成肝细胞样明显的多边形或立方体形,核仁椭圆,形态一致,边界清晰。 4、qRT-PCR检测细胞表面标记物及功能蛋白基因水平的表达,显示诱导分化后rALMSC-H表达ALB、HNF-4α、CYP1A2、CYP2B2以及CYP3A2,其中ALB、CYP1A2、以及CYP3A2表达水平显著高于未分化的rALMSC。HNF-4α以及CYP2B2表达水平均有升高,且接近原代成熟肝细胞表达水平,但分化前后表达水平无统计学差异。 5、诱导分化后的rALMSC-H肝脏特异性功能鉴定。免疫荧光结果显示诱导分化后的rALMSC-H胞浆内白蛋白阳性。上清检测rALMSC与rALMSC-H均具有合成尿素氮的能力,体外诱导分化使rALMSC-H合成尿素能力显著高于rALMSC。液相色谱-质谱分析仪检测结果显示,分化前rALMSC具有微弱的细胞色素P450(CYP1A2)活性,分化后rALMSC-H细胞色素P450(CYP1A2)活性显著增加。 6、药物诱导肝细胞毒性检测。实验结果显示扑热息痛、双氯芬酸、酮康唑、氯丙嗪、奎尼丁、氟他胺均对分化后rALMSC-H具有细胞毒性,且趋势与原代肝细胞一致,但rALMSC-H对各药物敏感性不一。其中,rALMSC-H对氯丙嗪、酮康唑、氟他胺的敏感性与原代肝细胞几乎一致；对扑热息痛、双氯芬酸、奎尼丁的敏感性较原代肝细胞略低。 结论 本研究成功从成年健康大鼠肝脏中分离出具有典型间充质干细胞特性的成体肝干细胞(rALMSC), rALMSC来源于非肿瘤组织,其分离过程不涉及转染等基因工程技术,安全性高。rALMSC经过体外生长因子诱导分化后,可形成具有肝脏特异性功能的肝样细胞(rALMSC-H)、rALMSC-H可表达ALB、HNF4、CYP1A2、 CYP2B2、CYP3A2,具有合成白蛋白、尿素的能力和细胞色素P450活性,并能代谢肝毒性药物,具有作为药物检测用细胞的潜能,为解决肝细胞来源问题提供了一种新的方法。
【关键词】：成体肝干细胞 间充质干细胞 诱导分化 肝细胞 药物检测
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-17
• 材料和方法17-36
• 1. 材料和试剂17-21
• 2. 实验方法21-35
• 3. 统计分析35-36
• 结果36-46
• 讨论46-52
• 全文小结52-53
• 参考文献53-59
• 附录59-71
• 缩写词简表71-72
• 攻读硕士学位期间的成果72-73
• 致谢73-74

【参考文献】

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1 AmrAmin;AlaaEldinA.Hamza;;Effects of Roselle and Ginger on cisplatin-induced reproductive toxicity in rats[J];Asian Journal of Andrology;2006年05期

2 Raquel Taléns-Visconti;Ana Bonora;Ramiro Jover;Vicente Mirabet;Francisco Carbonell;José Vicente Castell;María José Gómez-Lechón;;Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年36期

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本文编号：301340