Moesin磷酸化在1-磷酸鞘氨醇介导的内皮细胞反应中的作用

发布时间：2017-04-14 00:02

  本文关键词：Moesin磷酸化在1-磷酸鞘氨醇介导的内皮细胞反应中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血管内皮在循环和周围组织之间作为半选择性屏障参与调节很多生理过程,比如蛋白质和物质的转运、炎症和血管新生。抗炎反应介导的内皮屏障功能障碍是脓毒症引起血管渗出和肺水肿直接的根本原因,也是血管新生、肿瘤代谢和动脉粥样硬化必不可少的因素。因此,保持内皮细胞屏障功能的完整性具有重要的临床治疗意义。 前人的研究已经提出这样一种内皮细胞屏障功能调节模型,即血管屏障功能由抗内皮细胞收缩力(这种收缩力产生向心性张力)和细胞间粘附及细胞基质的约束力(这种约束力由焦附着力和粘附连接强制产生)的平衡来调节,这二者也参与调节细胞形态的改变。 血小板源性磷脂1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)可有效提高内皮细胞屏障功能,这一过程涉及由GTP酶依赖性Rac介导的肌动蛋白在细胞周边的重排。S1P是一种存在于血浆中的具有生物活性的神经鞘磷脂,主要由血小板合成和分泌,其他细胞如红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞以及内皮细胞都能够分泌SIP。SIP的浓度可通过复杂的代谢过程而被调节,其浓度的变化直接影响其生物学效应。S1P在细胞内可作为第二信使,与调节性分子如酶、通道蛋白、转录因子等相互作用而发挥效应；S1P还可以作为细胞外配体,与几乎存在于所有细胞种类的S1P膜受体结合,并通过不同的信号转导通路,影响细胞的生存、增殖、分化、迁移和形态变化等,发挥广泛的生物学效应。S1P受体为G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),目前至少发现有5种,分别为S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5,分布于不同的细胞。内皮细胞主要表达S1PR1、S1PR2和S1PR3,表达水平S1PR1S1PR3S1PR2。不同亚型的S1P受体结合的G蛋白不尽相同,其中S1PR1与Gi相偶联,S1PR2/3则与Gi, Gq、G12/13偶联。另外,S1PR1和S1PR2/3对S1P的亲和力也有区别,生理浓度下S1P主要与S1PR1结合；浓度较高(如超过5μmol/L时)则与S1PR2/3结合。有研究发现,生理浓度(0.5μmol/L-1.0μmol/L)下S1P与S1PR1结合,介导Rac1依赖的内皮屏障保护作用；浓度较高时(5.0μmol/L-10.0μmol/L),则与S1PR2/3结合,介导RhoA依赖的内皮屏障损伤作用。三种受体表达及激活状态的动态平衡维持着正常内皮细胞的功能。我们的前期研究工作证明,内毒素和肿瘤坏死因子等炎性刺激可增加S1PR2的表达,并在介导内皮细胞功能损伤中发挥重要作用。 由S1P和其他保护因素如氧化磷脂、人生长因子、ATP或辛伐他丁需要肌动球蛋白重塑,包括在细胞周边肌动蛋白环的形成,磷酸化调节的肌球蛋白轻链在细胞周边的聚集,以及Rac依赖机制调节的中心应力纤维的消失。然而这些导致细胞骨架改变的信号通路的下游靶点还未完全明了。生理浓度下S1P对内皮细胞屏障功能的保护作用具有重要的临床治疗意义,有可能为感染、损伤等病理状态下的组织炎症,特别是为血管通透性的升高所导致的组织水肿提供治疗途径。因此,深入研究不同浓度的S1P对内皮细胞屏障功能的影响和机制,对于将来在治疗上发挥并加强S1P的内源性血管通透性稳定因子的作用、防治过量S1P所引起的内皮屏障功能损伤等具有重要的意义。 普遍存在的ERM家族膜相关蛋白(ezrin,radixin,moesin)调控特定域的细胞周边的结构和功能。ERM蛋白是连接肌动蛋白丝和浆膜的肌动蛋白结合连接蛋白,或者直接通过结合跨膜蛋白或间接通过肌球蛋白连接到跨膜蛋白上。ERM蛋白参与细胞粘附、细胞形态、细胞运动、细胞动力学和膜整合的信号转导通路等细胞生命活动。活化状态的ERM蛋白受磷酸化反应的严格调控。ERM蛋白激活的方式主要有两种,一是通过与膜脂质PIP2结合,另一种是通过保守的C端苏氨酸的磷酸化(ezrin的T567,radixin的T564,moesin的T558)而被激活。几种激酶已应用于通过磷酸化C端苏氨酸残基来调节ERM蛋白的功能。 ERM蛋白也可与信号分子联合参与细胞生命过程(需要膜细胞骨架重组)。ERM蛋白似乎在GTP酶家族的Rho的下游和上游都起调节肌动蛋白骨架的重塑的作用。然而,目前有关ERM蛋白在对不同兴奋剂引起的内皮细胞骨架重塑中发挥的可能作用研究不多。Koss和他的同事认为ERM蛋白在苏氨酸残基上由TNF-α介导磷酸化的信号转导过程并有可能在调制细胞骨架变化和在人肺微血管内皮细胞通透性增高中起重要作用。我们的前期研究工作证明,晚期糖基化终产物通过激活RhoA进而导致其下游靶分子ROCK的磷酸化,并通过直接与moesin蛋白相互作用激活moesin蛋白,进而引起内皮细胞形态和功能的改变,血管通透性增加。 已有研究证明,ERM蛋白是生理浓度S1P保护内皮细胞屏障功能反应的必需条件,Radixin在促进S1P介导的内皮细胞屏障保护功能中有特异性的促进作用,而noesin则相反,对这一过程起抑制作用。三种不同的ERM蛋白差异性地调控由S1P介导的肺内皮细胞骨架和通透性的变化。鉴于moesin在血管内皮细胞屏障功能下降和血管通透性升高中的促进作用,我们推测moesin蛋白在高浓度S1P引起的血管通透性增加中可能有作用,所以本课题主要研究moesin磷酸化在高浓度S1P介导的内皮细胞屏障功能障碍中的作用。 目的 我们前面已经描述：生理剂量的S1P(0.5μmol/L-1.0μmol/L)与S1PR1结合,介导Racl依赖的内皮屏障保护作用；而高浓度的S1P(5.0μmol/L-10.0μmol/L)与S1PR2/3结合,介导RhoA依赖的内皮屏障损伤作用。本实验室前期研究已证明：1.AGEs通过诱导]moesin磷酸化,导致内皮细胞形态和功能的改变,进而引起血管通透性增高。2.S1PR2/3介导了高浓度S1P对内皮屏障功能的破坏作用。本研究试图探讨高浓度S1P通过S1PR2/3,是否可以介导1moesin蛋白的苏氨酸磷酸化,从而导致内皮细胞屏障功能障碍,为进一步阐明高浓度S1P介导内皮细胞屏障功能损伤的作用机制提供实验依据,并为防治血管通透性增加提供新的思路和有效的手段。 方法 本课题以人脐静脉内皮细胞株HUVEC为研究对象,应用细胞培养、免疫印迹、siRNA干扰、跨内皮细胞电阻(TEER)测定等方法,通过观察高浓度S1P刺激下moesin蛋白表达和磷酸化水平的变化,及其对内皮细胞骨架形态、屏障功能的影响,阐明moesin在高浓度S1P介导的内皮细胞形态和功能变化中的作用。 人脐静脉血管内皮细胞分别接种于35mm培养皿、微孔小皿(Petri dish)和铺有1%明胶的双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5mm,孔径大小0.4μm),待细胞长至融合后,换无血清培养基8h使细胞获得同步生长。用浓度为10μmol/L的S1P与细胞共同培养不同时间,并设立空白对照组。在各实验处理组中,分别用可溶性S1PR1拮抗剂(W146)、S1PR2拮抗剂(JTE-013)、S1PR3拮抗剂(CAY10444)预处理内皮细胞；或用moesin siRNA预转染内皮细胞,并设立阴性对照组进行比较,均继以S1P培养20min。 结果 1.S1P以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs moesin磷酸化 在相同的浓度(10μmol/L SIP), SIP以时间依赖的方式引起moesin磷酸化,并在20min内,各浓度的S1P都能以时间依赖的方式引起1moesin磷酸化,而在20mmin后,高浓度S1P介导的moesin磷酸化进入一个相对稳定的平台期,90min后noesin磷酸化水平基本恢复。浓度梯度的S1P(0、0.5、1.0、5.0和10.0μmol/L)刺激HUVECs20min后,各浓度刺激组与对照组相比有显著性差异(P0.001),其中以10.0μmol/L刺激引起的moesin磷酸化水平最高。上述实验结果证明：S1P以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs moesin磷酸化。 2.高浓度S1P通过S1PR2/3介导moesin磷酸化 S1PR1拮抗剂(W146)、S1PR2拮抗剂(JTE-013)、S1PR3拮抗剂(CAY10444)分别预处理HUVECs30min,再用高浓度S1P(10μmol/L)刺激20min后,结果证明W146和S1PR3拮抗剂(CAY10444)预处理组moesin磷酸化水平变化与S1P (10μmol/L)刺激组无统计学差异,而JTE-013预处理组加S1P(10μmol/L)刺激组的]moesin磷酸化较单纯S1P (10μmol/L)刺激组明显减少,具有统计学差异(P0.05)。上述实验结果证明：高浓度S1P通过S1PR2介导moesin磷酸化。 3.下调moesin表达后可减轻高浓度S1P介导的屏障破坏作用 将HUVECs种植在35mm培养皿里,转染lnoesin的siRNA干扰moesin的表达,证明moesin的表达确实降低,用S1P (10μmol/L)刺激,moesin的磷酸化水平也随之被降低。 在功能学方面,将HUVECs种植在transwell小室里,转染,moesin的siRNA干扰moesin的表达后再用S1P(10μmol/L)刺激,测定90min内跨内皮细胞电阻。S1P(10pmol/L)刺激组和转染对照组加S1P刺激后跨内皮细胞电阻明显降低,在20min时变化最明显(P0.001),提示内皮细胞屏障功能减弱；转染moesin siRNA加S1P刺激组电阻变化幅度小,没有统计学差异(P0.05),证明下调1moesin表达后会减少高浓度S1P介导的屏障破坏作用,提示moesin蛋白在高浓度S1P介导的内皮细胞通透性增加中具有重要作用。 在形态学方面,将HUVECs种植在Petri dish里,转染moesin siRNA干扰moesin的表达后,再用S1P (10μmol/L)刺激20min,经过多聚甲醛固定、0.5%曲通打孔、5%BSA封闭后再孵育荧光F-actin抗体,PBS洗4次2min/次后观察内皮细胞F-actin形态变化。结果显示,S1P组与对照组相比,应力纤维形成明显增加；与S1P组比较,下调moesin表达能显著抑制高浓度S1P刺激组应力纤维的形成,提示下调noesin表达后能改善高浓度S1P对内皮细胞的形态学变化。以上结果证明:moesin磷酸化参与了高浓度S1P介导的内皮细胞屏障损伤作用。 结论 1.S1P以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs moesin磷酸化； 2.Moesin磷酸化通过S1PR2参与高浓度S1P介导的内皮细胞屏障功能损伤作用； 3.Moesin磷酸化参与了高浓度S1P介导的内皮细胞屏障破坏作用。
【关键词】：1-磷酸鞘胺醇 S1P受体 moesin 内皮细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 材料与方法25-36
• 结果36-45
• 讨论45-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 英文缩略词55-57
• 硕士期间取得的成果57-58
• 致谢58-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 程杨;何勉;;ERM蛋白的生物学功能及其与妇科肿瘤的联系[J];国外医学.妇产科学分册;2006年05期

2 刘湘兰;王占华;李强;黄绪亮;黄巧冰;;1-磷酸鞘氨醇对烧伤后血管通透性的作用研究[J];中国微循环;2008年05期

  本文关键词：Moesin磷酸化在1-磷酸鞘氨醇介导的内皮细胞反应中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304743