结核分枝杆菌Rv1787基因编码蛋白PPE25的原核表达及生物信息学分析
发布时间：2021-02-23 15:46
目的构建结核分枝杆菌Rv1787基因的原核表达质粒进行体外表达,运用生物学信息分析方法分析Rv1787基因编码蛋白PPE25的生物学特征。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增Rv1787基因,并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表达产物并利用亲和层析的方法进行纯化。利用生物信息学软件ProtParam分析PPE25蛋白的理化性质,TMPRED和SignalP4.1 Service预测蛋白的跨膜区和信号肽,NPS@SOPMA和Swissmodel分别预测蛋白的二级结构和三级结构,Bepipred 1.0b server和DNAStar综合预测蛋白的B细胞抗原表位,综合运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、RANKPEP、NetMHCⅡPAN 4.0 server预测蛋白的CTL细胞表位,综合运用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHCⅡpan 3.2 server预测蛋白的Th细胞表位。结果 pET-32a-Rv1787重组质粒测序结果与目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体形式...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图１Ｒｖ１７８７基因扩增ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＲｖ１７８７ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１Ｒｖ１７８７ＰＣＲ产物
，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃图３不同诱导条件下ＲＶ１７８７融合蛋白的表达１ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ２１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃３２ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃Ｆｉｇ．３ＴｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｏｉｎｄｕｃｅＲＶ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１菌体裂解后上清液２菌体裂解后沉淀３８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌体上清液４８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌体沉淀图４Ｒｖ１７８７融合蛋白表达形式１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ２Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／Ｌｕｒｅａ４Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／ＬｕｒｅａＦｉｇ．４ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｏｒｍｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ４重组融合蛋白的纯化将裂解后的包涵体离心后收集上清液，采用镍离子亲和层析的方法进行纯化后获得一天单一的蛋白条带，相对分子质量大小约为５６×１０３，与预期大小一致。从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明，５０ｍｍｏ／Ｌ咪唑为最佳洗脱浓度（图５）。５蛋白的生物信息学分析５．１理化性质分析采用ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件对ＲＶ１７８７编码的ＰＰＥ２５蛋白的理化性质进行分析，结果显示ＰＰＥ２５蛋白相对分子质量为３７×１０３，理论等电点为９．８０，原子总量为５２０３，消光系数为６４４００；
氨基酸组成，分子式为Ｃ１６６３Ｈ２５８８Ｎ４６０Ｏ４８０Ｓ１２，主要由Ａｌａ（２１．６％），Ｇｌｙ（９．６％）和Ｓｅｒ（９．０％）构成，带正电荷的氨基酸残基（Ａｓｐ和Ｇｌｕ）总数为１３，带负电荷的氨基酸残基（Ａｒｇ和Ｌｙｓ）总数为２０。１包涵体上清液２穿透液３１０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑４２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑５３０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑６５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑７１００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑图５Ｒｖ１７８７融合蛋白纯化１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｌｙｔｉｃｉｎｃｌｕｓｉｏｎ２ＴｈｅｆｌｕｉｄｆｌｏｗｅｄｔｈｒｏｕｇｈＮｉｃｋｅｌｉｏｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ４Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ２０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ５Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ３０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ；Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ５０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚ－ｏｌｅ７Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１００ｍｍｏｌ／ＬｉｍｉｄａｚｏｌｅＦｉｇ．５ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ５．２跨膜区域和信号肽分析采用ＴＭＰＲＥＤ工具对ＰＰＥ２５蛋白跨膜区域进行预测，结果显示得分大于５００的区域有１１个，包括
【参考文献】：
期刊论文
[1]结核分枝杆菌LepB蛋白的功能预测及生物信息学分析[J]. 袁秋露,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(08)
[2]结核分枝杆菌BfrB蛋白的生物信息学分析[J]. 袁秋露,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(02)
[3]结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位预测[J]. 王东方,白雪娟,刘银萍,梁艳,吴雪琼,林明贵. 生物医学工程学杂志. 2016(02)
[4]生物信息学技术在病原生物学中的应用[J]. 高洁,张雷. 中国病原生物学杂志. 2015(01)
[5]结核潜伏感染蛋白Rv1737cB细胞、CTL及Th表位预测与分析[J]. 白雪娟,赵亚静,梁艳,吴雪琼. 实用临床医药杂志. 2015(03)
[6]MHC-Ⅱ类抗原表位预测软件的对比评价[J]. 李胜涛,刘昌文,邹泽红,陶爱林. 生物医学工程研究. 2010(02)
本文编号：3047834
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图１Ｒｖ１７８７基因扩增ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＲｖ１７８７ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１Ｒｖ１７８７ＰＣＲ产物
，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃图３不同诱导条件下ＲＶ１７８７融合蛋白的表达１ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ２１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃３２ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃Ｆｉｇ．３ＴｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｏｉｎｄｕｃｅＲＶ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１菌体裂解后上清液２菌体裂解后沉淀３８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌体上清液４８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌体沉淀图４Ｒｖ１７８７融合蛋白表达形式１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ２Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／Ｌｕｒｅａ４Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／ＬｕｒｅａＦｉｇ．４ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｏｒｍｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ４重组融合蛋白的纯化将裂解后的包涵体离心后收集上清液，采用镍离子亲和层析的方法进行纯化后获得一天单一的蛋白条带，相对分子质量大小约为５６×１０３，与预期大小一致。从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明，５０ｍｍｏ／Ｌ咪唑为最佳洗脱浓度（图５）。５蛋白的生物信息学分析５．１理化性质分析采用ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件对ＲＶ１７８７编码的ＰＰＥ２５蛋白的理化性质进行分析，结果显示ＰＰＥ２５蛋白相对分子质量为３７×１０３，理论等电点为９．８０，原子总量为５２０３，消光系数为６４４００；
氨基酸组成，分子式为Ｃ１６６３Ｈ２５８８Ｎ４６０Ｏ４８０Ｓ１２，主要由Ａｌａ（２１．６％），Ｇｌｙ（９．６％）和Ｓｅｒ（９．０％）构成，带正电荷的氨基酸残基（Ａｓｐ和Ｇｌｕ）总数为１３，带负电荷的氨基酸残基（Ａｒｇ和Ｌｙｓ）总数为２０。１包涵体上清液２穿透液３１０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑４２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑５３０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑６５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑７１００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑图５Ｒｖ１７８７融合蛋白纯化１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｌｙｔｉｃｉｎｃｌｕｓｉｏｎ２ＴｈｅｆｌｕｉｄｆｌｏｗｅｄｔｈｒｏｕｇｈＮｉｃｋｅｌｉｏｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ４Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ２０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ５Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ３０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ；Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ５０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚ－ｏｌｅ７Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１００ｍｍｏｌ／ＬｉｍｉｄａｚｏｌｅＦｉｇ．５ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ５．２跨膜区域和信号肽分析采用ＴＭＰＲＥＤ工具对ＰＰＥ２５蛋白跨膜区域进行预测，结果显示得分大于５００的区域有１１个，包括
【参考文献】：
期刊论文
[1]结核分枝杆菌LepB蛋白的功能预测及生物信息学分析[J]. 袁秋露,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(08)
[2]结核分枝杆菌BfrB蛋白的生物信息学分析[J]. 袁秋露,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(02)
[3]结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位预测[J]. 王东方,白雪娟,刘银萍,梁艳,吴雪琼,林明贵. 生物医学工程学杂志. 2016(02)
[4]生物信息学技术在病原生物学中的应用[J]. 高洁,张雷. 中国病原生物学杂志. 2015(01)
[5]结核潜伏感染蛋白Rv1737cB细胞、CTL及Th表位预测与分析[J]. 白雪娟,赵亚静,梁艳,吴雪琼. 实用临床医药杂志. 2015(03)
[6]MHC-Ⅱ类抗原表位预测软件的对比评价[J]. 李胜涛,刘昌文,邹泽红,陶爱林. 生物医学工程研究. 2010(02)
本文编号：3047834
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