轮状病毒VP7糖蛋白基因的克隆及在毕赤酵母菌中的表达及免疫原性的分析

发布时间：2021-02-27 04:36

　　轮状病毒（Rotavirus,RV）是一种双链核糖核酸病毒,属于呼肠孤病毒科,流行病学调查显示,轮状病毒是秋冬季引起婴幼儿感染性腹泻的重要致病因子,全世界每年有大约一亿人感染该病毒。目前,研制安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段之一。本研究通过基因克隆和重组技术检测20份患儿的粪便标本,提取病毒RNA,再逆转录为cDNA,根据GenBank中发表的VP7全序列设计引物,应用RT-PCR技术,从分离的轮状病毒中扩增出来960bp特异性目的片段,并构建融合表达载体pPICZαA-VP7,转入GS115毕赤酵母中。经1%甲醇诱导,镍柱亲和层析蛋白纯化,获得浓度为0.65mg/mL单一目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot分析VP7蛋白的表达。结果显示克隆的VP7基因与预计的糖蛋白基因大小一致,构建的重组表达载体在GS115毕赤酵母中表达出分子质量约34kD重组糖蛋白,说明成功克隆和表达了轮状病毒的糖蛋白基因。经小鼠免疫实验结果表明,VP7蛋白加强免疫2周后,肌注组（IM）和滴鼻组（IN）小鼠IgG抗体几何平均滴度分别达到492和676,滴鼻组SIgA平均几何滴度达到43... 

【文章来源】：病毒学报. 2019,35(05)北大核心

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
材料与方法
    1菌种与标本来源
    2主要试剂
    3培养基
    4病毒总RNA的提取
    5 RT-PCR扩增目的片段
    6重组毕赤酵母表达载体的构建
    7 VP7目的蛋白的表达
    8重组抗原VP7免疫动物实验
    9抗体水平检测
    10ELISPOT检测分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞数[20]
结果
    1 VP7基因的克隆
    2阳性重组克隆的筛选
    3重组表达质粒PCR与酶切鉴定结果
    4 VP7蛋白的纯化及鉴定
    5 VP7融合蛋白的表达
    6 VP7免疫小鼠血清IgG抗体水平
    7 VP7免疫小鼠肠匀浆SIgA抗体水平及中和效价检测
    8 ELISPOT计数分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞
讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]酶联免疫吸附试验法与化学发光免疫分析法检测乙型肝炎病毒血清学标志物的准确率[J]. 张万平.  医疗装备. 2019(10)
[2]轮状病毒肠炎患儿粪便IL-6、IL-8的动态水平变化检测及意义[J]. 杨辉.  湖北科技学院学报(医学版). 2019(01)
[3]复方甘草酸苷注射液治疗轮状病毒肠炎合并肝功能异常80例分析[J]. 王沁芳,赵青.  中国药物与临床. 2019(03)
[4]轮状病毒检测及诊断研究进展[J]. 许春,谬如君,赖宇.  医学理论与实践. 2018(24)
[5]布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 成璐,张冬星,吴娟,李影.  动物医学进展. 2018(12)
[6]金双歧联合醒脾养儿颗粒对小儿轮状病毒腹泻的疗效及对血清IgM、IgG和IgA的影响[J]. 盛玮,田玉珍.  现代消化及介入诊疗. 2018(04)
[7]中国轮状病毒感染性腹泻免疫预防进展[J]. 刁连东,汤奋扬,吴疆,孙晓冬.  中国疫苗和免疫. 2018(04)
[8]猪轮状病毒VP融合蛋白的构建及其免疫原性研究[J]. 姚帅,徐进平.  安徽农业科学. 2018(19)
[9]结构蛋白VP4、VP6和VP7对牛轮状病毒的致病作用[J]. 冯春花,郭东光,陈明艳.  现代畜牧科技. 2018(06)
[10]以Aβ4-11为免疫原制备Aβ1-42多克隆抗体[J]. 张松江,赵献敏,王权,吕明惠,苏少华.  生命科学研究. 2017(05)

博士论文
[1]DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究[D]. 云涛.西北农林科技大学 2010

硕士论文
[1]黑曲霉CBS 513.88来源的甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[D]. 李折折.湖北大学 2015
[2]EV71地方株的分离鉴定及其VP1基因真核表达载体构建与免疫活性初步研究[D]. 陈伟.安徽医科大学 2009
[3]猪轮状病毒JL94株VP4基因克隆及其主要抗原位点的原核表达[D]. 宋岩.东北农业大学 2004



本文编号：3053695