耐辐射球菌PprI蛋白在毕赤酵母中的表达、发酵和纯化技术的研究

发布时间：2021-03-05 03:40

　　目的：利用毕赤酵母高效表达耐辐射奇球菌PprI蛋白，对pxxx/YYY毕赤酵母重组工程菌株诱导表达，并对PprI蛋白的诱导表达、纯化和发酵条件进行研究，并建立相应的表达、纯化和发酵技术路线，获得大量的PprI蛋白，为进一步研究PprI蛋白的作用机理及生物效应提供实验资料。材料与方法：构建毕赤酵母重组表达质粒pxxx-His-pprI，将鉴定正确的重组质粒pxxx6×His-pprI经Sal I酶切线性化，电转化毕赤酵母YYY感受态细胞并进行筛选，挑取经鉴定为阳性的pxxx-6×His pprI毕赤酵母转化子进行培养，加入甲醇至终浓度为1%进行诱导表达。SDS-PAGE电泳，Western blotting，质谱鉴定目的蛋白。采用离子交换、SFF（Ni）镍鳌合亲和层析、凝胶层析过滤和咪唑洗脱进行蛋白纯化，SDS-PAGE电泳检测。采用Bradford法进行His-PprI蛋白质浓度测定。外源蛋白表达条件，诱导时间、补加甲醇浓度、溶氧、发酵液pH值等方面逐个进行实验优化。用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，以蛋白含量高低及蛋白电泳条带明暗为优化标准，以标准品的浓度与相应的OD值做出标准曲... 

【文章来源】：苏州大学江苏省

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.双酶切pCMV-HA-pprI质粒的电泳检查

第一部分 耐辐射球菌 PprI 蛋白在毕赤酵母中的表达、发酵和纯化技总体积为 100 μl将上述 PCR 反应体系分装为每管 20μl，加入模板 1 ul。混匀后进行 PCPCR 反应程序如下：94℃ 变性 5 min94℃ 变性 1 min50℃ 退火 1 min72℃ 延伸 2 min25 cycle72℃ 延伸 10 minPCR 反应结束后，将反应产物全部上样进行琼脂糖凝胶电泳检查。结果显示，第 6、11 号转化子可扩增出 pprI 的特征性条带，表明这 性重组克隆。

图 3. pPIC9K-pprI 毕赤酵母转化子培养上清液的 SDS-PAGE 电泳构建毕赤酵母表达载体 pHBM-pprIHis-pprI 基因编码序列的合成与密码子优化赤酵母密码子的偏爱性对耐辐射奇球菌 R1（Deinococcus rAAF09762.1，Gene ID: 1798483）中的蛋白质编码序列进行的合成与 DNA 测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。物合成合成 pprI 基因的序列设计引物，在其上游引入 6×His 标签分别为：R-F:GTCACATCATCACCACCATCATGTTCCATCTGCTAACR-R: GGCCATTATTGGGCAGCATCTTGTGGTTCA


本文编号：3064511