HCMV体外感染SD乳鼠海马神经细胞致钙代谢障碍机制的研究

发布时间：2017-04-14 22:02

  本文关键词：HCMV体外感染SD乳鼠海马神经细胞致钙代谢障碍机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的建立人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）体外感染SD乳鼠海马神经细胞模型，探讨HCMV感染对体外培养的SD乳鼠海马神经细胞内钙离子影响及其机制。方法取24小时内出生的SPF级SD乳鼠雌雄各10只，通过神经细胞原代培养，建立原代乳鼠海马神经元单层细胞；在体外培养的第8天（In vitro8th）将生长良好的单层神经元细胞，建立HCMV体外感染SD乳鼠海马神经细胞模型，在接种后12h、48h分别将单层细胞经mRNA提取经行RT-PCR和多聚甲醛固定神经细胞培养物然后经行免疫组织化学；检测神经细胞培养物上的HCMV的即早期蛋白基因（IE gene）的转录和早期蛋白(E)表达情况，证明HCMV接种到SD乳鼠海马神经细胞上的复制性和增殖性；对体外感染模型验证。建模成功后进行分组，把培养的神经细胞随机分为HCMV感染组（神经细胞培养液加入病毒混悬液50ul）、HCMV+MK-801组（神经细胞培养物上加病毒混悬液50ul和MK-801）、MK-801组(在神经细胞培养物上加入MK-801)和对照组(在神经细胞培养物上加入人胚肺成纤维细胞上清液)；每组设10个复孔。在接种HCMV24h、48h、96h后分别在倒置显微镜观察感染组和对照组神经细胞的变化；在分组处理后24小时用Fluo-3AM钙离子探针进行荧光染色，分别在激光共聚焦显微镜下检测各组神经元游离钙离子的荧光强度值。结果接种HCMV24h后神经元后出现逐渐出现变圆、肿胀，96h后大部分细胞裂解消失；通过RT-PCR和免疫组织化学；结果显示在HCMV感染的海马神经细胞中可见HCMV即早期蛋白基因的转录及早期蛋白的表达,RT-PCR电泳显示与阳性HCMV IE1完全一致，测序后与IE1序列一致；免疫组化显示HCMV感染组呈棕黄色颗粒,苏木素复染后呈棕褐色，HCMV能在海马神经细胞内复制、增殖，体外感染模型成功建立。HCMV组神经元细胞内游离钙离子荧光强度值为（215.47±14.86）高于对照组（116.43±5.9）（t=15.2, P0.01）；MK-801+HCMV组神经元的荧光强度值(135.52±8.58)较HCMV组（215.47±14.86）明显下降，下降率为37±3.4%（t=11.3,P0.01）,MK-801组的荧光强度值为（88.05±4.50）较对照组（116.43±5.9)荧光强度值明显下降，，下降率为24±6.7%（t=-9.3, P0.01）。结论HCMV AD16株感染体外培养大鼠海马神经元可致细胞内的钙超载，NMDA受体通道介导的钙离子内流可能是HCMV感染后神经元内钙超载的主要机制之一。
【关键词】：激光共聚焦显微镜 人巨细胞病毒 大鼠神经元 细胞学 钙超载
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 1 引言9-12
• 2 材料方法12-18
• 3 结果18-25
• 4 讨论25-32
• 5 结论32-33
• 参考文献33-38
• 附录38-39
• 致谢39-40
• 综述40-48
• 参考文献45-48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Effects of Rat Cytomegalovirus on the Nervous System of the Early Rat Embryo[J];Virologica Sinica;2012年04期

  本文关键词：HCMV体外感染SD乳鼠海马神经细胞致钙代谢障碍机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：306928