面向病毒侵染机制研究的基于量子点的单颗粒示踪方法

发布时间：2021-03-07 20:45

　　许多病毒在人类历史上引起过地区性或全球性流行性疾病的大爆发,不仅对人类生存和健康构成重大威胁,也给社会财富造成了巨大的损失。深入研究病毒的侵染机制对病毒性疾病的预防及早期诊疗具有非常重要的意义。病毒侵染宿主细胞的过程是相当复杂的,往往包含多个步骤,并涉及病毒与各种细胞结构之间复杂的相互作用。因此,迫切需要一种技术能够实时原位地研究病毒在宿主细胞内的侵染行为,而单颗粒示踪技术是研究生物事件动态过程的强有力工具,能很好地满足病毒侵染机制研究的需要。进行单颗粒示踪的首要条件是对病毒结构进行荧光标记。但是,许多传统的荧光标记物亮度低、光稳定性差,不能满足长时间单颗粒示踪的需求,往往需要消耗大量的时间和精力来获取用于统计分析的数据。量子点具有亮度高、光稳定性好等优异的荧光性质,作为标记物非常适用于活细胞内高信噪比长时间的单颗粒示踪,在生物学领域引起了研究者的广泛关注。在本工作中,以禽流感H9N2病毒为模型,建立了一套基于量子点的单颗粒示踪方法,为进一步深入研究病毒的侵染机制奠定了基础。同时该方法也有希望被广泛地用于其它生物医学研究领域。本论文主要研究工作如下：发展了一种基于量子点的高效单病毒标记... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 单颗粒示踪技术
    1.2 荧光标记物
        1.2.1 荧光蛋白
        1.2.2 有机荧光染料
        1.2.3 量子点
    1.3 成像装置
        1.3.1 倒置荧光显微镜
        1.3.2 全内反射荧光显微镜
        1.3.3 共聚焦荧光显微镜
    1.4 数据分析
        1.4.1 颗粒定位
        1.4.2 轨迹重建
        1.4.3 轨迹分析
    1.5 单颗粒示踪技术在生物领域的应用
        1.5.1 细胞膜结构和功能研究
        1.5.2 分子马达运输机制研究
        1.5.3 染色质运动机制研究
        1.5.4 病毒侵染机制研究
    1.6 本文的选题背景及主要研究内容
    参考文献
第2章 基于量子点的单颗粒示踪方法的建立
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 试剂与仪器
        2.2.2 溶液配制
        2.2.3 细胞培养及病毒扩增
        2.2.4 量子点及Cy3分别标记流感病毒的包膜
        2.2.5 量子点与DiD同时标记流感病毒包膜
        2.2.6 量子点与Syto 82分别标记流感病毒包膜和RNA
        2.2.7 免疫荧光法标记流感病毒包膜蛋白血凝素
        2.2.8 量子点标记麦胚凝集素
        2.2.9 荧光标记A549细胞的细胞核、质膜、微丝及微管
        2.2.10 抑制实验
        2.2.11 共聚焦成像
        2.2.12 图像处理
        2.2.13 病毒滴度的测定
        2.2.14 单颗粒三维图片的模拟
        2.2.15 三维示踪精度评估
        2.2.16 三维高斯非线性最小二乘拟合法
        2.2.17 三维质心法
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 单颗粒示踪成像平台的搭建
        2.3.2 基于量子点的高效单病毒标记策略
        2.3.3 维单颗粒示踪方法的建立
        2.3.4 三维单颗粒示踪方法的建立
    2.4 结论
    参考文献
第3章 利用基于量子点的单颗粒示踪技术研究禽流感病毒的侵染机制
    3.1 引言
    3.2 实验方法
        3.2.1 试剂及仪器
        3.2.2 荧光标记MDCK细胞的微丝、微管、Rab5及Rab7蛋白
        3.2.3 药物抑制试验
        3.2.4 图像处理
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 流感病毒在单个细胞内的群体化侵染行为分析
        3.3.2 流感病毒依赖于微管的运动行为分析
        3.3.3 流感病毒在细胞内不同区域的运动行为分析
        3.3.4 流感病毒侵染过程的五阶段分析
        3.3.5 流感病毒在细胞核周围的运动行为分析
        3.3.6 流感病毒与Rab5及Rab7蛋白相关的运动行为分析
    3.4 结论
    参考文献
第4章 总结及展望
    参考文献
附录 作者攻读博士学位期间已发表及待发表的研究成果
致谢



本文编号：3069778