乙型脑炎病毒野毒株SA14包膜蛋白K279M突变对其神经毒力的影响

发布时间：2021-03-20 09:45

　　目的构建乙型脑炎病毒野毒株SA14包膜蛋白K279M突变株感染性克隆并拯救病毒,探索K279M突变对其毒力的影响。方法应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含有K279M突变的乙脑突变病毒全长cDNA质粒,经酶切鉴定后,以其为模板体外转录获得RNA,电转染BHK21细胞,得到恢复病毒JEV SA14 （K279M）。分别用野毒株JEV SA14和JEV SA14 （K279M）接种BHK21细胞和脑内接种昆明鼠,比较突变株与野毒株的蚀斑大小、生长特点以及对昆明鼠的神经毒力。结果酶切鉴定表明,突变病毒感染性克隆成功构建。病毒蚀斑试验显示,JEV SA14 （K279M）的蚀斑直径约为2～3 mm,大于野毒株蚀斑直径的1～2 mm。突变株病毒LD50为0.21PFU,大于野毒株病毒LD₅₀的0.05PFU。结论乙脑包膜蛋白K279M突变增大了病毒的蚀斑,但降低了病毒的脑内神经毒力。 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(09)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图１重叠延伸ＰＣＲ扩增含２７９突变ＤＮＡ片段示意图Ｆｉｇ．１ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆＫ２７９ＭｍｕｔａｔｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｂｙＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ

２条片段，其中ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ双酶切得到约０．５和５．６ｋｂ２条片段；ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ双酶切得到约２．２ｋｂ和３．９ｋｂ２条片段；ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩ双酶切得到约０．８和５．３ｋｂ２条片段（图４），与理论值相符。Ｍ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ１５０００）Ｍ２ＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）１引物Ｆ２和Ｅ２７９Ｒ配对扩增产物２引物Ｅ２７９Ｆ和Ｒ３配对扩增产物３引物Ｆ２和Ｒ３配对扩增产物图３含Ｅ２７９突变ｐｒＭ／Ｅ重叠延伸ＰＣＲ扩增产物Ｍ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）Ｍ２ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＦ２ａｎｄＥ２７９Ｒ２ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＥ２７９ＦａｎｄＲ３３ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＦ２ａｎｄＲ３Ｆｉｇ．３ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ·３０１１·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年９月第１４卷第９期Ｓｅｐ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．９

Ｍ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩＭ２ＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）图４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇酶切鉴定Ｍ１ＤＮＡ－ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩＭ２ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）Ｆｉｇ．４ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇３全长质粒ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）的酶切鉴定用限制性内切酶酶切ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）全长质粒并进行１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图５。其中经ＢａｍＨＩ单酶切片段约１３．６ｋｂ，ＢｓｐＥＩ＋Ｘｈｏｌ双酶切片段约７．５和６．１ｋｂ，ＢｇｌＩＩ单酶切片段约５．０、４．０、３．０、１．２ｋｂ，与理论值相符。Ｍ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）／ＢａｍＨＩ２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１

【参考文献】：
期刊论文
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[3]乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响[J]. 杨健,李玉华,李竹石,林华,汪伟,刘丽娜,倪谦枝,曾献武,杨会强.  川北医学院学报. 2013(04)



本文编号：3090798