融合抗原PstS1-LEP原核表达及血清学诊断

发布时间：2017-04-16 20:14

  本文关键词：融合抗原PstS1-LEP原核表达及血清学诊断，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)引起的结核病死灰复燃,常规结核病化疗对耐药、耐多药结核病治疗效果降低。虽然结核病预防有卡介苗(BCG),治疗有一线、二线抗结核化疗药物,然而全球结核病疫情仍十分严重,仍然是世界公共卫生问题。结核病控制包括诊断、治疗、预防,随着分子生物学技术发展,不断发现用于结核病诊断和疫苗研制的M.tb抗原及其衍生抗原。 目的：本研究通过大肠杆菌表达M.tb融合蛋白PstS1-LEP,并作为抗原,采用ELISA法检测结核患者、肺外结核患者、肺部疾病患者以及健康人血清学抗PstS1-LEP IgG抗体,旨在评价新融合抗原用于结核病血清学诊断的价值。 方法：(1)利用在线数据库SYFPEITHI分析20个蛋白的抗原表位,筛选得分高12条Th表位肽,每条15个氨基酸,首尾相连组成一条多肽LEP,根据大肠杆菌偏爱的密码子设计编译LEP的碱基序列,由上海生物工程技术有限公司进行全基因合成(N端引入BamH I酶切位点和C端引入Hind Ⅲ酶切位点)。目的基因经DNA测序验证正确后与pET-28a-pstsl载体相连,将重组质粒pET-28a-pstsl-LEP转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白。融合蛋白PstS1-LEP经DEAE阴离子亲和层析纯化并稀释透析复性。蛋白免疫印迹法(western blotting)检测复性的PstS1-LEP蛋白与结核病患者来源血清和抗PstS1单抗反应；该蛋白作为抗原,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺结核患者、肺外结核患者、肺部疾病患者和入伍新兵来源的血清IgG抗体,旨在评价该蛋白在血清学诊断方面的价值。 结果：人工合成了LEP蛋白编码基因,该基因克隆到PET-28a-PstS1载体,重组质粒经酶切鉴定,正确的重组质粒进行全基因测序表明与LEP编码碱基序列一致。重组PstS1-LEP蛋白在大肠杆菌中获得表达,离子交换层析获得较纯目的蛋白,复性后蛋白浓度为1.25mg/ml。PstSl-LEP与结核病患者血清和抗PstSl单抗呈阳性反应。肺结核患者血清中抗PstSl-LEP IgG抗体水平较高,显著高于肺外结核病组、肺部疾病组和健康人组(P0.05)。208例肺结核患者和43例PPD-健康者血清IgG OD492nm.采用ROE分析确定临界值为0.43,PstSl-LEP用于血清学诊断的灵敏度和特异性、阳性预示值、阴性预示值分别为69.5%、68.4%、79.9%和55.3%；PstSl-LEP用于肺结核患者血清学诊断敏感度显著高于肺外结核(78.8%vs52.2%,χ2=23.60,P=0.000)。208例肺结核患者和46例肺部疾病患者血清IgG0D492nm采用ROC分析确定临界值为0.44,PstS1-LEP用于血清学诊断的灵敏度和特异性、阳性预示值、阴性预示值分别为67.9%、93.2%、94.8%和61.6%。采用不同对照进行ROC曲线分析获得不同的cutoff值,以肺部疾病组作对照,显著提高了PstSl-LEP血清学诊断特异度。研究发现接种BCG影响PstSl-LEP血清学诊断,因为卡痕组抗PstSl-LEP IgG抗体水平显著高于无卡痕组(P=0.008)；健康者皮试反应大小也影响PstSl-LEP血清学诊断,因为PPD皮试阳性健康组抗PstSl-LEP IgG抗体水平显著高于PPD皮试阴性健康组(P0.05)。因此,BCG接种和Mtb感染均可能影响PstSl-LEP血清学用于活动性结核病的诊断；因此,该抗原虽然有一定诊断价值,但其诊断敏感度和特异度还不能满足临床诊断要求。 结论：PstSl-LEP在大肠杆菌中表达并具有免疫原性,为进一步评价PstSl-LEP作为疫苗的候选抗原奠定基础。
【关键词】：结核分枝杆菌 线性表位 原核表达 血清学诊断
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 文献综述9-25
• 中英文缩略25-27
• 1.引言27-29
• 2.材料29-31
• 2.1 血清样本29
• 2.2 主要试剂29-30
• 2.3 主要设备30-31
• 3.实验所需试剂配制31-35
• 3.1 SDS-PAGE电泳所需试剂31-32
• 3.2 LB培养基32
• 3.3 碱裂解法抽提质粒溶液32-33
• 3.4 核酸电泳所需试剂33
• 3.5 蛋白纯化、复性所需试剂33-34
• 3.6 免疫印迹所需试剂34
• 3.7 ELISA所需试剂34-35
• 4.方法35-41
• 4.1 LEP编码基因人工合成35
• 4.2 原核表达载体pMD19-T-LEP的构建35-36
• 4.3 原核表达载体pET-28a(+)-PstS1-LEP的构建36-37
• 4.4 诱导表达37-38
• 4.5 免疫印迹鉴定血清免疫原性38-39
• 4.6 Lowry法测PstS1-LEP蛋白浓度39
• 4.7 ELISA检测血清抗体39-40
• 4.8 统计分析40-41
• 5.结果41-61
• 5.1 重组质粒pMD19-T-LEP表达载体的构建41
• 5.2 pET-28a-PstS1LEP重组表达载体的构建41-42
• 5.3 重组PstS1-LEP蛋白的诱导表达、纯化42-44
• 5.4 PstS1-LEP融合蛋白的免疫印迹44-46
• 5.5 蛋白含量的确定46-47
• 5.6 研究对象构成特征47
• 5.7 ELISA检测结果47-53
• 5.8 不同临界值下血清学诊断评价53-61
• 6.讨论61-65
• 7.结论65-67
• 8.参考文献67-75
• 致谢75-77
• 已发表论文77

【参考文献】

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1 吴传勇;娄加陶;蒋廷旺;钱

本文编号：311589