带Flag标签的Sirt2真核表达载体的构建及其与PKM2的相互作用

发布时间：2021-04-15 22:36

　　目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2（Sirt2）真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶（PKM2）的相互结合。方法利用聚合酶链反应（PCR）从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切后pcDNA3.0-Flag载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,验证表达,测序正确后,分别转染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共转染至人胚肾细胞（293T）,通过免疫共沉淀实验证明Sirt2蛋白表与PKM2蛋白有相互结合。结果重组质粒Flag-Sirt2的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;免疫共沉淀实验证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合。结论成功构建了Flag-Sirt2真核表达载体,证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合,为进一步研究Sirt2在糖酵解中发挥的功能提供了基础。 

【文章来源】：军事医学. 2019,43(07)北大核心

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

PCR扩增人Sirt2基因

FFllaagg--SSiirrtt 2双酶切电泳图

293T细胞分别转染pcDNA3.0-Flag与Flag-Sirt2质粒24 h后，收集细胞行Western印迹检测Sirt2蛋白表达情况。结果显示，转染pcDNA3.0-Flag质粒的样品无特异性条带；转染Flag-Sirt2质粒的样品约在相对分子质量43×103处可见特异性条带（图4）。2.3免疫共沉淀实验验证Sirt2蛋白与PKM2蛋白相互结合


本文编号：3140212