RGD-Ins蛋白结构、活性及其基因治疗血栓研究

发布时间：2021-05-09 02:03

　　本论文通过基因工程的方法，把源于天然蛇毒的去整合素dendroaspin中的一段含RGD（Arg-Gly-Asp）功能序列的13肽（CFTPRGDMPGPYC）基因及改变此13肽两端的两个半胱氨酸为两个丝氨酸的13肽（SFTPRGDMPGPYS）基因分别插入到突变的无活性人胰岛素原[A6-A11Ser]-HPI分子的B27和A1位点之间的基因中，从而取代掉[A6-A11Ser]-HPI分子上的C肽基因，构建成两个能展示RGD功能序列的人源化胰岛素基因，再通过分子克隆技术把这两个基因连接到温度诱导型表达载体质粒pBV220上，在大肠杆菌DH5α中进行高效表达（表达产率约为13％）。表达产物以不溶的包含体形式存在，再经超声破菌、包含体裂解、等电点沉淀、二硫键还原重组、SephadexG-50分子筛层析及反相柱层析等一系列步骤最终获得两个突变体蛋白RGD-Cys-Ins和RGD-Ser-Ins，两者的不同之处在于后者新插入的13肽上缺少了一对二硫键，使得RGD-Ser-Ins蛋白中的RGD功能序列及其周边几个氨基酸所构成的局域构象比RGD-Cys-Ins的更为松散灵活，缺乏刚性。对这两个蛋白... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写表
第一章 前言
    第一节 胰岛素及胰岛素基因工程研究概况
        一、胰岛素研究概况
        二、胰岛素基因工程研究概况
    第二节 RGD肽及其整合素受体家族研究现状
        一、RGD肽及其整合素受体家族
        二、RGD-多肽与抗血栓
        三、RGD-多肽与骨质疏松
        四、RGD-多肽与肿瘤治疗
    第三节 基因治疗研究现状
    第四节 本论文的立题依据及工作背景
        一、立题依据
        二、本实验室相关的工作
        三、实验的可行性
第二章 实验材料、仪器及方法
    第一节 实验材料、仪器
        一、实验材料
        二、仪器设备
        三、常用溶液配方
    第二节 实验方法
        一、常规的分子克隆技术
        二、目的蛋白的表达与分离纯化
        三、表达产物的性质测定
        四、生物活性测定
第三章 突变 RGD-Ins蛋白的结构与活性研究
    第一节 突变 RGD-Ins基因的构建
        一、空间结构模拟分析结果
        二、突变基因的构建
        三、目的基因的分析鉴定
    第二节 RGD-Ins蛋白的分离、纯化及活性分析
        一、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的分离及纯化
        二、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的性质分析
        三、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的生物活性比较
    第三节 讨论
第四章 pCMV-RGD-Ins基因治疗及预防血栓研究
    第一节 含引导肽pCMV-RGD-Ins基因的构建与制备
        一、pCMV-RGD-Ins基因的构建
        二、pCMV-RGD-Ins基因的大量制备及酶切鉴定
    第二节 pCMV-RGD-Ins基因体内转入及其表达的检测
        一、pCMv-RGD-Ins基因的体内转入
        二、pCMv-RGD-Ins基因在小鼠骨胳肌中表达的检测
    第三节 pCMV-RGD-Ins转基因小鼠相关指标的变化
        一、pCMV-RGD-Ins转基因小鼠血清胰岛素样物质浓度的变化
        二、pCMv-RGD-Ins转基因小鼠出血时间的改变
        三、PCMv-RGD-Ins转基因小鼠血糖浓度的变化
    第四节 讨论
第五章 总结与展望
参考文献
致谢
博士期间发表的论文目录
附文一
附文二


【参考文献】：
期刊论文
[1]抗凝活性肽RGD226基因构建、表达、产物纯化及活性分析[J]. 杨兴文,刘俭,唐建国.  中国生物化学与分子生物学报. 2002(05)



本文编号：3176399