小鼠microRNA 130a/b的转录调控和功能研究

发布时间：2021-05-27 07:52

　　MicroRNA（miRNA）是真核生物中位于非编码区的一类小RNA,他们在各种疾病和生理过程中起着非常重要的作用。其中miR-130a/b对白血病、脂肪生成等重要生理过程具有调控作用。然而,miR-130a/b的转录调控以及其在代谢和炎症方面的功能目前还远未研究清楚。本实验采用细胞转染、双荧光素酶报告系统、基因定点突变、染色质免疫共沉淀（ChIP）、荧光定量PCR、小鼠腹腔注射等实验技术,对miR-130a/b的转录调控机制进行了研究。我们发现C/EBPa可直接作用于miR-130a/b的启动子来调节其转录活性。取得的主要结果如下：1、克隆了小鼠miR-130a/b的启动子序列,并将它们构建于PGL3-Basic载体中。在BHK21细胞系中验证其启动子活性；2、通过荧光活性分析证实了C/EBPa对miR-130a的启动子活性具有显著的抑制作用,而对于miR-130b的启动子活性有显著性的上调；3、突变和ChIP实验确定了C/EBPa对miR-130a/b的关键作用位点和二者的直接相互结合；4、功能研究上,验证了miR-130a/b对3T3-L1细胞在成脂分化雌中的表达量显著下降,在稳... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 MiRNA
    1.2 MiRNA的转录调控与生物加工
    1.3 MiRNA的作用机制
        1.3.1 翻译起始抑制
        1.3.2 翻译起始后抑制
        1.3.3 介导mRNA衰减
        1.3.4 正调控和去抑制
    1.4 MiRNA与疾病
        1.4.1 MiRNA与炎症
        1.4.2 MiRNA与脂肪分化
    1.5 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验细胞
        2.1.2 实验菌株
        2.1.3 实验质粒
    2.2 实验试剂
        2.2.1 主要实验试剂
        2.2.2 主要溶液的配置
        2.2.3 主要实验仪器
        2.2.4 分子生物学相关软件
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞基因组DNA的制备
        2.3.2 小鼠miR-130a/b启动子序列扩增及双荧光真核报告表达载体构建
        2.3.3 DNA电泳检测PCR产物及回收纯化
        2.3.4 DNA片段的克隆与测序
        2.3.5 质粒的大量提取
        2.3.6 细胞的瞬时转染
        2.3.7 细胞总RNA提取、纯化和反转录
        2.3.8 实时定量PCR
    2.4 双荧光素酶报告系统检测
        2.4.1 试剂准备
        2.4.2 细胞裂解
        2.4.3 被动裂解
        2.4.4 检测样品
    2.5 染色质免疫共沉淀
    2.6 数据统计分析
3 结果与分析
    3.1 miR-130a/b对3T3-L1前体脂肪细胞成脂分化的影响
    3.2 小鼠miR-130a/b对SP1和TNF α表达的影响
    3.3 LPS处理对小鼠miR-130a/b的表达影响
    3.4 小鼠miR-130a/b启动子克隆与转录因子结合位点预测
    3.5 转录因子对小鼠miR-130a/b启动子活性影响
    3.6 小鼠miR-130a/b启动子全长及截短活性分析
    3.7 C/EBP α对小鼠miR-130a/b启动子活性的调节
    3.8 MiR-130a/b启动子上受C/EBP α调节的关键位点分析
    3.9 C/EBP α与miR-130a/b启动子的特异性结合
    3.10 BHK21细胞中C/EBPα对miR-130a和miR-130b的表达量影响
4 讨论
5 结论与创新点
    5.1 结论
    5.2 创新点
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA*生物合成及其功能研究的新发现[J]. 马圣运,白玉,韩凝,王君晖,翁晓燕,边红武,朱睦元.  遗传. 2012(04)



本文编号：3207200