小类泛素化修饰在肺炎支原体感染中作用的研究

发布时间：2017-04-24 13:01

  本文关键词：小类泛素化修饰在肺炎支原体感染中作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的转录因子NF-kB广泛存在于哺乳动物细胞内,它可以调节细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体基因的表达,影响机体内的细胞分化、免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤生长等多种生物学功能。NF-kB是由p65和p50组成的异源二聚体,细胞处于静息状态时,NF-kB二聚体通过非共价键形成与ikB结合于细胞质中呈无生物活性。但是ikB可以被泛素化修饰,泛素化修饰后的ikB将会在26S蛋白酶的作用降解,从而释放NF-kB,使其入核从而进行相关的基因转录。 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)作为一种常见的人源致病性支原体,其全球感染呈上升趋势。报道显示亚洲12个医学中心1756例社区获得性肺炎患者的非典型微生物流行状况,Mp感染率达己达22.4%。其感染除了引起原发型非典胜肺炎、咽炎、气管炎、支气管炎等呼吸道疾病以外,还可引起全身各系统的合并症,因此清除这一病原体极其困难。细胞内定位、免疫调节效应和表面抗原变异都可能导致支原体感染发生。因此对于肺炎支原体的致病机理以及宿主免疫系统抵抗感染的机制已经成为现今研究的热点之一 小类泛素化修饰肽(small ubiquitin-like modifier, SUMO)于20世纪末被发现,广泛存在于真核生物中,是高度保守的蛋白家族。小类泛素化修饰(SUMOylation, SUMO化修饰)是一种已经被广泛认知的细胞内的重要调控方式,它参与细胞的多种生理生化反应,而调节该过程的酶是维持修饰系统精确表达的重要保障。最新的研究显示,SUMO化修饰在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)感染宿主的过程中起着重要的作用。SUMO化反应与泛素化反应相反,它可以抑制NF-κB的功能,主要是通过SUMO与泛素竞争iKB第373位的赖氨酸残基来实现的。这样就可以阻断ikB的泛素化,从而抑制NF-κB的功能。 本论文旨在揭示SUMO化修饰在Mp感染过程中的作用,为Mp致病机制的研究提供新方向和新思路。 方法 1.应用Real time PCR方法检测人单核细胞株THP-1对Mp的清除作用； 2.应用细胞计数法和LDH法检测Mp体外对THP-1生长的影响； 3.应用PI染色法检测THP-1细胞凋亡情况； 4.应用western blot法和免疫共沉淀法测定Mp作用后单核细胞THP-1内源性结合型SUMO、iκB及SUMO-iκB复合体的表达变化； 5. ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α。 结果 1.108CCU/ml Mp刺激THP-1细胞24hr内Mp随着作用时间增长,DNA浓度呈现降低趋势,感染4hr和24hr Mp DNA减少数值具有统计学意义(p0.05)。随着作用时间延长,Mp DNA浓度出现升高趋势； 2.107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp分别感染THP-1细胞24hr后,细胞计数结果表明,随着Mp刺激浓度的增加,细胞减少增多,结果具有显著性差异； 3.乳酸脱氢酶(LDH)结果显示,107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp感染THP-1细胞24hr,48hr和72hr后,细胞上清中所含LDH量均增高,和正常细胞相比,Mp感染的THP-1细胞膜均有破损,LDH通过破损细胞膜进入细胞培养液中,结果具有显著性差异(P0.05)； 4.PI染色法检测细胞凋亡结果显示107CCU/ml Mp刺激THP-124hr,48hr后G2/M期细胞数量明显增多,S期细胞数量下降,细胞凋亡明显； 5.Mp感染THP-1细胞0hr,8hr,24hr,48hr后,western blotting结果显示,细胞内结合型SUMO表达量呈增加趋势；iKB表达量也呈增加趋势；Co-IP结果显示,SUMO-iκB结合体表达量明显增加。 结论 通过我们的实验证明,Mp可能主要是通过两个途径来逃避单核细胞株THP-1的清除作用的： 1.Mp可以诱导人单核细胞株THP-1的凋亡来逃避免疫系统的清除； 2.Mp可以通过提高ikB的小类泛素化修饰水平抑制NF-kB信号通路的活化,进而来逃避免疫系统的清除作用。 本实验证明Mp能够促进THP-1的凋亡,同时提高细胞中iKB的小类泛素化修饰水平进而抑制NF-kB通路,使Mp能够顺利逃避机体免疫系统,免于被机体清除,从而致病。
【关键词】：肺炎支原体 iκB 凋亡 小类泛素化修饰 THP-1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R375.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-16
• 研究现状、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、高浓度Mp诱导THP-1细胞凋亡16-26
• 1.1 对象和方法16-21
• 1.1.1 研究对象16-17
• 1.1.2 试剂与仪器17
• 1.1.3 方法17-21
• 1.1.3.1 CCU法测定Mp浓度17
• 1.1.3.2 Mp感染THP-1细胞17-18
• 1.1.3.3 Mp RNA的提取18
• 1.1.3.4 Real time PCR反应18-19
• 1.1.3.5 显微镜下细胞计数19-20
• 1.1.3.6 LDH法测细胞活性20
• 1.1.3.7 PI染色法检测细胞凋亡20-21
• 1.1.4 统计学处理21
• 1.2 结果21-24
• 1.3 讨论24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、Mp改变THP-1细胞中iκB的小类泛素化修饰水平26-37
• 2.1 对象和方法26-32
• 2.1.1 研究对象26-27
• 2.1.2 试剂与仪器27
• 2.1.3 方法27-32
• 2.1.3.1 细胞总蛋白提取27
• 2.1.3.2 Western blotting实验27-30
• 2.1.3.3 免疫共沉淀30-31
• 2.1.3.4 ELISA检测TNF-α31-32
• 2.1.3.5 蛋白定量软件分析32
• 2.1.4 统计学处理32
• 2.2 结果32-35
• 2.3 讨论35-36
• 2.4 小结36-37
• 结论37-38
• 参考文献38-42
• 发表论文和参加科研情况说明42-43
• 附录43-44
• 综述 肺炎支原体与哮喘及其致病机制44-59
• 综述参考文献55-59
• 致谢59

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